枸杞离体快速繁殖技术研究及蛋白质含量测定

李梓欣， 孙萌， 李亚男， 何橙， 晋一帆， 孙志艺

（山东中医药大学药学院，山东 济南，250000）

[摘要]目的：选用宁夏枸杞不同部位为外植体，探究不同外植体、不同灭菌时间、激素配比不同对于宁夏枸杞组织培养的影响，测定其蛋白质含量并与野生种对比。方法：以枸杞的嫩叶、嫩茎为外植体，探讨培养基类型、植物激素类型、激素浓度、消毒时间、接种方式、等对培养结果的影响，为优化枸杞快速繁殖体系提供依据，并通过测定紫外分光光度计对野生枸杞和栽培枸杞蛋白质含量进行对比和分析。结果：最佳消毒试剂及时间：75%酒精30 s+0.1%升汞8 min；以MS培养基为基本培养基，诱导丛生芽分化的最佳培养基：NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L，诱导率为86.67%，死亡率为13.33%；诱导芽增殖的最佳培养基：NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L，诱导率为76.67%，死亡率为23.33%；最佳生根培养基：NAA0.6mg/L+6-BA1.5mg/L，大量生根且根系浓密，栽培枸杞比野生枸杞的蛋白质含量明显增多。

[关键词]枸杞；蛋白质；组织培养

[Abstract] Objective:Using the different parts of Lycium barbarum from Ningxia as explants,discussing the effects of different explants ,different disinfection time and hormone concentration on process of tissue culture,determined the change of protein content.Methods:Using the young leaves and tender stems as explants, the effects of media type, plant hormone type, hormone concentration, disinfection time, inoculation method, etc. on culture results were explored to provide basis for optimizing the rapid propagation system of Lycium barbarum,and by measuring the absorbance to compare and analyzed the protein in wild and cultivated barbarum .Result:The Best disinfection reagents and time:75% alcohol 30 s+0.1% HgCl2 8min;MS medium as basic medium,the best medium for inducing bud differentiation:NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L,the induction rate is 86.67% and the mortality rate is 13.33%;the optimal medium for inducing shoot proliferation:NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L,the induction rate is 76.67% and the mortality rate is 23.33%;the best rooting medium:NAA0.6mg/L+6-BA1.5mg/L,multi-root and roots thick,the protein content of cultivated Lycium barbarum is significantly higher than wild earthworms.

[Key words] Lycium barbarum;Protein;Tissue culture

枸杞为茄科，枸杞属多年生落叶灌木，在世界范围内约有80多个种，是一个世界分布属[1]，我国枸杞有7个品种，3个变种，多数分布在我国的西北和华北地区。枸杞是我国传统的“药食同源”[2]的中药材之一，在《神农本草经》、《本草纲目》中均有记载，具有软化血管、降低胆固醇、祛风明目、润肝清肺[3]等功效。现代药理学研究发现枸杞嫩茎叶富含甜菜碱、芦丁以及多种人体所需的氨基酸、多糖以及微量元素等。随着当今经济快速发展以及越来越多人注重保健和养生，枸杞这类既有医疗保健作用又有丰富的营养价值的“中药蔬菜”[4]已成为时代发展的需要，目前食用的枸杞主要来源于野生采集和人工栽培，但是野生资源有限，人工种植生产周期长、占地面积大，因此对枸杞种植提出了更高的要求。杜国利[5]等人通过实验得出以大量元素培养基为基本培养基，采用不同浓度的激素配比，优化了枸杞繁殖的再生条件；唐晓杰[6]等人通过对宁夏枸杞的种子进行快速繁殖技术研究，得出枸杞最适宜的初代培养基为MS+BA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L；目前对于枸杞多糖成分的研究和报道较多，对蛋白质含量测定的研究较少，卫彬颉[7]通过对栽培枸杞与野生枸杞进行营养成分分析，发现栽培枸杞蛋白质、总糖、VC等含量明显高于野生枸杞，本研究旨在通过快速繁殖技术，探讨培养基类型、植物激素类型等影响因素对培养结果的影响，优化枸杞快速繁殖体系，提高枸杞繁殖速率，优化野生枸杞与栽培枸杞蛋白质含量分析内容，为今后对枸杞快速繁殖和营养成分研究提供借鉴。

1.材料、仪器与试剂

1.1材料

试验材料采自山东中医药大学药圃中。

1.2仪器

超净工作台(上海康路仪器设备有限公司)，高温蒸汽灭菌锅(SANYO, MLS-3780 )，超纯水系统(Mili-Q )，电子分析天平（FA2004，上海良平仪器仪表有限公司）；PH计（Sartorius PB-10,北京赛多利斯科学仪器有限公司；超声震荡仪（KQ2200，昆山市超声仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（H-1850R，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-3010，日本日立公司）电热鼓风干燥箱，电子天平，培养瓶若干，微量移液器，100ml、10ml量筒若干，500ml、1000 ml烧杯若干，培养皿，锥形瓶等。

1.3试剂

无水乙醇（分析纯）(天津市富宇精细化工有限公司)、现配0.1%升汞、无菌水、蔗糖(国药集团化学试剂有限公司)、琼脂粉（北京奥博星生物技术有限公司）、6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）(济南圣和化工有限公司)、NAA（α-萘乙酸）(济南圣和化工有限公司)、纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；Tris（Amresco,93349）；1M HCl；蔗糖；考马斯亮蓝（G250）；NaOH（分析纯）；牛血清蛋白（Amresco）

2.方法

2.1组培处理方法

采摘新鲜枸杞，将叶片摘下，并将嫩茎剪成带4-5个腋芽的小段，用毛刷蘸取少量用水稀释的洗衣粉将其表面的杂质清洗干净，分别将叶片与嫩茎段放入盛有自来水的烧杯中浸泡3-5分钟，后用流动的自来水冲洗3-5次，在超净操作台内进行消毒：分别用75%的酒精浸泡（20、30、40s），用无菌水摇洗1-2次，再用0.1%HgCl2溶液分别消毒（6、8、10min），然后用无菌水冲洗4-5次，在无菌培养基上切成含有1-2个腋芽[8]的小段，分别接种在含有0.8g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，PH控制在5.7-5.8，添加不同植物激素浓度的培养基中，在每个培养基中分别接种4-5个外植体，接种完毕后放于植物组织培养室中，温度保持在23-25 ℃，光强2200 lx，光照周期12 h/24 h。

2.2溶液的配置和蛋白质提取

2.2.1试剂配置

浓缩胶缓冲液：精密称取Tris5.98g和1M HCl48.0ml溶解，调节溶液PH至6.7，定容至100ml，过滤，4℃储存备用。

考马斯亮蓝G250溶液：精密称取考马斯亮蓝G250 100mg，加入95%乙醇50ml，超声溶解，溶液显蓝色，待考马斯亮蓝溶解后再加入85%磷酸溶液120ml搅拌，溶液呈血红色，最后用纯净水定容至1000ml，溶液呈褐色，超声4h，用定量滤纸过滤，备用。

蛋白质标准溶液：精密称取10mg牛血清蛋白，用少量纯净水溶解，定容至100ml，配置成0.1mg/ml的蛋白质标准母液。分别吸取母液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml分别定容至10ml，配置成0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.10mg/ml的蛋白质标准溶液，4℃储存备用。

2.2.2碱法提取蛋白质

称取野生枸杞叶和栽培枸杞叶干粉各1.0g，按照1:70（g/ml）的比例加入提取剂（NaOH溶液，最佳浓度为0.1-0.2mol/L），在45℃下振荡浸提，后用4000rmp离心20min，吸取上清液用于测定水溶性蛋白质含量，4℃储存备用。

2.3统计公式

诱导率（%）=（生成芽数/接种数）×100%

污染率（%）=（污染鳞片数/接种鳞片数）×100%

精密吸取待测溶液1ml，加入5ml考马斯亮蓝显色5min，在595nm处测定其吸光度，平行测定三次。计算总蛋白质含量（%）=CD/W*100

C-供试品中蛋白质含量（mg）

D-供试品的稀释因子

W-供试品质量

3.结果与分析

3.3.1诱导培养基

3.1.1 外植体的选择

表1不同外置体及放置方式对诱导率的影响

编号 外植体类型 放置方式 接种数（个） 诱导数（个） 诱导率

（%）

1 嫩叶 平放 30 11 36.67

2 嫩叶 形态学下端没入培养基 30 17 56.67

3 嫩茎 平放 30 22 73.33

4 嫩茎 形态学下端没入培养基 30 26 86.67

由表1可知，外植体的选材部位及放置方式对诱导效果有很大的影响，其中选取枸杞嫩茎并将形态学下端没入培养基的培养方式诱导率最高，为86.67%，嫩叶的诱导率远远小于嫩茎。结果表明枸杞嫩茎具有较大的器官发生潜能[9]，因此，枸杞嫩茎为最佳外植体，以将形态学下端没入培养基中的方式接种。

3.1.2消毒灭菌时间

表2消毒灭菌时间对枸杞嫩茎诱导的影响

编号 75%酒精处理时间

（s） 0.1%升汞处理时间

（min） 接种数

（个） 污染数

（个） 污染率

（%） 诱导数（个） 诱导率

（%）

1 20 6 30 19 63.33 16 53.33

2 20 8 30 16 53.33 18 60.00

3 20 10 30 17 56.67 24 80.00

4 30 6 30 14 46.67 22 73.33

5 30 8 30 8 26.67 26 86.67

6 30 10 30 13 43.33 23 76.67

7 40 6 30 6 20.00 18 60.00

8 40 8 30 5 16.67 15 50.00

9 40 10 30 3 10.00 11 36.67

由表2可知，消毒时间不同，枸杞的诱导情况不同。消毒时间不够培养基容易受到污染且诱导率不高，消毒时间延长可以降低污染率，但由于消毒时间过长导致细胞活性降低，对诱导率有很大影响，整体来看，最佳的消毒时间为75%酒精30 s+0.1%升汞8 min，其污染率为26.67%，诱导率为86.67%。

3.1.3植物激素浓度

表3不同激素配比对枸杞嫩茎诱导的影响

编号 激素浓度

（mg/L）

6-BA NAA 接种数

（个） 诱导数（个） 诱导率

（%）

1 0 0.1 30 10 33.33

2 0.5 0.1 30 24 80.00

3 1.0 0.1 30 26 86.67

4 0.5 0 30 23 76.67

5 0.5 0.2 30 19 63.33

6 1.0 0.2 30 22 73.33

由表3可知，植物生长调节剂[4]的浓度配比很大程度上影响了外植体形成愈伤组织的诱导率，6-BA比NAA更容易促进细胞分裂形成愈伤组织，6-BA与NAA适当的配比可以提高外植体的诱导率，激素配比为NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L时诱导率最高，诱导效果最好。

3.2继代培养

表4不同激素配比对不定芽增殖的影响

编号 激素浓度

（mg/L）

6-B NAA 接种数

（个） 新增芽数

（个） 诱导率

（%） 诱导效果

1 0 0 30 0 0 无不定芽生成

2 0.5 0 30 9 30.00 生成少量不定芽且苗高易玻璃化

3 1.0 0 30 15 50.00 生成不定芽且苗高

4 0 0.5 30 12 40.00 不定芽少但健壮不易玻璃化

5 0.5 0.5 30 23 76.67 生成大量不定芽，苗高健壮

6 1.0 0.5 30 17 56.67 生成少量不定芽

7 0.5 1.0 30 14 46.67 生成少量不定芽

8 1.0 1.0 30 11 36.67 生成少量不定芽

由表4可知，不同激素配比对不定芽增殖有很大影响。只添加NAA的培养基可以诱导生成不定芽，不定芽少但健壮而且不易玻璃化，只添加6-BA的培养基诱导形成的不定芽数量多苗高但易玻璃化，所以，一定的激素配比可以提高不定芽的诱导率且诱导生成的不定芽苗高健壮且不易玻璃化，最佳的激素配比为NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L。

3.3生根培养

表5不同激素配比对不定芽生根的影响

编号 激素浓度

（mg/L）

6-BA NAA 诱导效果

1 0 0 无生根

2 0.5 0 无生根

3 0 0.5 少量生根

4 0.5 0.5 少量生根

5 1.5 0.5 少量生根

6 0.5 0.6 大量生根

7 1.5 0.6 大量，生根且根系浓密

8 1.5 1 少量生根

由表5可知，植物激素NAA对生根具有明显的影响。NAA能促进生根，促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，低浓度的NAA起促进作用，高浓度的NAA则有抑制作用，当激素浓度配比为NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L时，生根数量最多且根系浓密，为最佳生根培养基激素配比。

3.4蛋白质含量测定

方法 编号 枸杞粉末

质W(mg) 吸光度 供试品中

蛋白质含量C(mg) 稀释因D 总蛋白质含量

碱法提取 野生1 1000 2.305 19.1804345 1 0.019180435

野生2 1000 2.3 19.139 1 0.019139

野生3 1000 2.302 19.1555738 1 0.019155574

培养1 1000 3.943 32.7543767 1 0.032754377

培养2 1000 4.016 33.3593204 1 0.03335932

培养3 1000 4.002 33.2433038 1 0.033243304

对野生枸杞和培养枸杞进行蛋白质提取，分别测定其吸光度对比其蛋白质含量，通过对比发现，经过离体快速繁殖培养的枸杞中的蛋白质含量明显高于野生枸杞中的蛋白质含量，我们可以通过离体快速繁殖技术，设定不同激素配比，增加枸杞中有效成分的含量，提高枸杞的药用价值。

4.小结

在植物离体快速繁殖过程中，外植体的选择和处理、植物激素的浓度配比都是影响诱导效果的重要因素。处理外植体过程中需要控制好消毒时间，由于组织培养操作过程高度要求无菌，所以要求我们提高对很多细节的把握，如灭菌后用滤纸擦干表面水分以免二次污染、及时清理长菌样品以免对其他物品的污染，除此之外还要注意不同阶段对温度、湿度、光照的把握等。植物激素6-BA[10]具有明显的促进细胞分裂，诱导愈伤组织的发生以及促进芽生成的作用，NAA则具有明显的促进生根的作用，但具有低浓度促进，高浓度抑制的特点，诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L，诱导不定芽的最佳培养基为MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L，诱导生根的最佳培基为MS+NAA0.6mg/L+6-BA1.5mg/L；通过对栽培枸杞和野生枸杞进行蛋白质含量测定，栽培枸杞的蛋白质含量明显高于野生枸杞，通过离体快速繁殖技术，我们不仅能缩短栽培周期，还能通过特定的方法，使用特定的激素提高枸杞中营养成分的含量，增加其药用价值，本研究将会为今后更加深入的研究提供坚实的基础与指导。

参考文献

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