高效液相色谱法和电位滴定法测定盐酸萘甲唑啉原料药含量
董海霞 刘学艳
燕禹辛 邢科
（山东标准检测技术有限公司 山东
济南
山东绅联药业有限公司 山东 菏泽）
摘要:目的 分别建立电位滴定法和高效液相色谱法测定盐酸萘甲唑啉原料药含量。方法 高效液相色谱法采用Waters XBridge C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为磷酸二氢钾缓冲液（取3.0g磷酸二氢钾，加水800 mL使溶解，加3.0 mL三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0，加水稀释至1000mL）-乙腈（80:20，V/V），流速为1.0 mL·min-1，检测波长280nm，柱温30℃。电位滴定法以乙醇为溶剂，用氢氧化钠标准溶液（0.1 mol·L-1）滴定，电位法判定终点。结果 高效液相色谱法：在0.02～76μg·mL-1范围内线性关系良好，r=0.999 8；方法精密度RSD为0.3%（n=6）；平均回收率为100.2%（n=9），RSD为0.5%。电位滴定法：在0.12～0.25 g范围内线性关系良好，r=0.999 8；方法精密度RSD为0.15%（n=6）；平均回收率为100.2%（n=9），RSD为0.15%。
关键词：高效液相色谱法；电位滴定法；盐酸萘甲唑啉；含量测定
Determination
of Naphazoline Hydrochloride by HPLC and potentiometry titration
Haixia Dong Xueyan Liu
Yuxin Yan Ke Xin
(SHANDONG STANDARD TEST
TECHNOLOGY CO.,LTD
SHANDONG SHENLIAN PHARMACEUTICAL
CO.,LTD)
Abstract:Objective To establish a potentiometry titration method and an
HPLC method for the determination of naphazoline hydrochloride. Methods
The HPLC method was performed on a C18 column (4.6mm×250mm,
5μm) with mobil phase of potassium dihydrogen phosphate buffer (take 3.0g
potassium dihydrogen phosphate, add 800 mL water to dissolve it, add 3.0 mL
triethylamine, adjust pH value to 3.0 with phosphoric acid, add water to dilute
to 1000 mL) -acetonitrile (80:20, V/V) at flow rate of 1.0 mL·min-1.
The UV detection was set at 280 nm and the colum temperature was matained at 30
℃. Ethanol was used as solvent for potentiometry titration. The sample solution
was titrated with 0.1 mol·L-1 sodium hydroxide solution. The end
point was decided by potentiometric method. Results HPLC: the liner
range for naphazoline hydrochloride was 0.02～76μg·mL-1 (r=0.999 8), the
precision RSD was 0.3% (n=6), the average recovery was 100.2% with an RSD of
0.5% (n=9). Potentiometry titration: the liner range for 0.12～0.25 g (r=0.999 8), the
precision RSD was 0.15 (n=6), the average recovery was 100.2% with an RSD of 0.15%
(n=9). Conclusion There was no significant difference between
the results of potentiometry titration method and HPLC method and indicated
that two methods both could be used to determine the content of naphazoline
hydrochloride substances.
Key words:HPLC；Potentiometry titration
method；Naphazoline hydrochloride
Determination
盐酸萘甲唑啉（Naphazoline hydrochloride），为拟交感神经血管收缩药，直接作用于结膜小动脉的α肾上腺素受体，使血管收缩，缓解因过敏性及炎症引起的结膜充血，主要制成水溶液制剂，如滴眼液、滴鼻液等，临床应用量大。《中国药典》1995年版规定，盐酸萘甲唑啉原料药采用非水滴定法测定，该方法操作繁琐。本文分别建立了电位滴定法和高效液相色谱（HPLC）法测定盐酸萘甲唑啉原料药含量，为盐酸萘甲唑啉原料药和制剂的质量控制研究奠定了基础。
图1 盐酸萘甲唑啉化学结构式
1
仪器与试药
1.1
仪器Waters e2695高效液相色谱仪（包括四元泵、自动进样器、PDA检测器和Empower 3工作站）；916
Ti-Touch自动电位滴定仪（瑞士万通）；QUINTIX125D-1CN电子分析天平（赛多利斯公司）；FE-28台式酸度计（梅特勒-托利多仪器）。
1.2
试药 盐酸萘甲唑啉样品（批号：170628、170714、170726），由本公司生产；盐酸萘甲唑啉对照品（批号：100111-201104，含量：99.2%），购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，ASTOON，4L/瓶）；磷酸二氢钾（分析纯，国药，500g/瓶）；三乙胺（分析纯，国药，500ml/瓶）；磷酸（分析纯，国药，500ml/瓶）；水为市售纯净水（杭州哇哈哈集团）；乙醇（分析纯，国药，500ml/瓶）。
2
方法与结果
2.1
高效液相色谱法
2.1.1
色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Waters
XBridge C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为磷酸二氢钾缓冲液（取3.0g磷酸二氢钾，加水800 mL使溶解，加3.0mL三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0，加水稀释至1000mL）-乙腈（80:20，V/V），流速1.0mL·min-1，检测波长280nm，柱温30℃，进样量20μL。在该色谱条件下，盐酸萘甲唑啉保留时间约为6.6min，理论塔板数大于6000，与相邻杂质分离度大于2.0。
2.1.2
溶液的配制 供试品溶液：取盐酸萘甲唑啉样品适量，精密称定，加流动相制成每1mL中含50μg的盐酸萘甲唑啉，作为供试品溶液；对照品溶液：取盐酸萘甲唑啉对照品适量，精密称定，加流动相制成每1mL中含50μg的盐酸萘甲唑啉，作为对照品溶液。
2.1.3
方法学考察
2.1.3.1 专属性试验 取盐酸萘甲唑啉样品适量，分别经酸、碱、氧化、高温及光照破坏后，进样分析。试验结果表明，盐酸萘甲唑啉样品仅在强碱破坏与高温破坏下由降解产物产生，且降解产物均能与主峰完全分离，各破坏条件下主峰峰纯度角小于阈值角，破坏实验色谱见图2。另取空白溶剂进样分析，空白溶剂峰对主峰无干扰。因此，盐酸萘甲唑啉较稳定，本法专属性良好。
图1 盐酸萘甲唑啉破坏性试验HPLC色谱图
2.1.3.2 线性关系试验 取盐酸萘甲唑啉样品约12.5mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，用流动相稀释得到系列浓度（25、38、51、63、76μg·mL-1）的对照品溶液。取上述溶液20μL，分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，盐酸萘甲唑啉浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，进行线性回归，结果见表1.表明在0.02～76μg·mL-1范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。
表1 线性试验结果
|
编号 |
定量限 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
C（μg/ml） |
0.02 |
25 |
38 |
51 |
63 |
76 |
|
峰面积 |
0.58 |
700.91 |
1051.99 |
1386.11 |
1763.25 |
2099.89 |
|
线性方程及相关系数 |
y=27.652x+1.03，相关系数r=0.9998 |
|||||
2.1.3.3 检测限及定量限 精密称取盐酸萘甲唑啉对照品适量，以流动相溶解并依次稀释，分别取20μL注入高效液相色谱仪。结果表明，本品的最小检测限浓度为0.007μg·mL-1，检测限为0.1ng（信噪比S/N=3）；最小定量限浓度为0.02μg·mL-1，检测限为0.4ng（信噪比S/N=10）。
2.1.3.4 精密度试验 取盐酸萘甲唑啉对照品溶液，连续进样6次，计算得峰面积的RSD为0.08%，表明本法进样紧密度良好。
2.1.3.5 重复性试验 取盐酸萘甲唑啉样品6份，照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液并测定，按外标法计算盐酸萘甲唑啉含量，测定样品平均含量为100.1%，RSD为0.3%，表明方法重复性良好。
2.1.3.6 中间精密度试验 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，由不同分析人员在不同时间使用不同仪器分别对6份供试品溶液进行测试，按外标法计算盐酸萘甲唑啉含量，测定样品平均含量为100.6%，RSD为0.7%，表明方法中间精密度良好。
2.1.3.7 稳定性试验 取供试品溶液，在室温下分别放置0、2、4、8、12、24h后测定，测得不同时间内盐酸萘甲唑啉峰面积RSD为0.3%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.1.3.8 加样回收率试验 用标准加样法进行盐酸萘甲唑啉回收率试验，计算回收率。按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，加流动相溶解并稀释制成浓度约为40、50、60μg·mL-1的溶液，各3份，依法测定，结果见表2。
表2 回收率试验结果
|
浓度 |
投入量（mg） |
测得量（mg） |
回收率（%） |
平均（%） |
RSD(%) |
|
80% |
10.40 |
10.41 |
100.1 |
100.2 |
0.5 |
|
10.39 |
10.35 |
99.6 |
|||
|
10.37 |
10.34 |
99.7 |
|||
|
100% |
12.80 |
12.88 |
100.6 |
||
|
12.79 |
12.84 |
100.4 |
|||
|
12.78 |
12.81 |
100.2 |
|||
|
120% |
15.09 |
15.11 |
100.1 |
||
|
15.24 |
15.33 |
100.6 |
|||
|
15.19 |
15.32 |
100.9 |
2.1.3.9 耐用性试验 按“2.1.2”方法制备对照品溶液和供试品溶液，分别考察流动相中流速、柱温及有机相比例对含量测定结果的影响程度。结果见表3，结果表明，各变化因素对测定结果无显著影响。
表3 耐用性试验结果
|
变化因素 |
实际值 |
含量(%) |
|
|
流速 |
0.5mL·min-1 |
100.8 |
|
|
1.0mL·min-1 |
100.8 |
||
|
1.5mL·min-1 |
100.5 |
||
|
柱温 |
20℃ |
100.2 |
|
|
30℃ |
100.8 |
||
|
40℃ |
100.1 |
||
|
流动相比例 |
磷酸盐缓冲液：乙腈（85:15） |
100.7 |
|
|
磷酸盐缓冲液：乙腈（80:20） |
100.8 |
||
|
磷酸盐缓冲液：乙腈（78:22） |
101.0 |
2.2 电位滴定法
2.2.1 测定方法 取盐酸萘甲唑啉样品约0.2g，精密称定，加0.01mol·L-1盐酸溶液5mL与乙醇50mL，振摇溶解后，摇匀，用0.1 mol·L-1氢氧化钠标准溶液滴定，电位滴定法滴定终点，两个突跃点体积的差作为滴定体积。
2.2.2 方法学考察
2.2.2.1 线性关系 分别精密称取本品0.12、0.15、0.175、0.2、0.25g，置滴定杯中，照拟定方法分别测定，记录滴定终点。以称样量为横坐标（X），滴定终点时氢氧化钠标准溶液消耗体积差为纵坐标（Y），考察其线性关系。样品量在0.12～0.25g范围内，回归方程为Y=40.842X-0.0859，r=0.999 8，测定结果呈良好的线性关系。
2.2.2.2
稳定性试验 取本品约0.2g，5份，精密称定，置滴定杯中，加0.01mol·L-1盐酸溶液5mL与乙醇50mL，振摇溶解后，分别于室温下放置0、2、4、8、23h后，照“2.2.1”项下拟定方法测定盐酸萘甲唑啉含量。测得结果显示平均含量为100.3%，RSD为0.3%，表明样品溶液在室温下23h稳定。
2.2.2.3 精密度试验 取本品约0.2g，6份，精密称定，置滴定杯中，照“2.2.1”项下拟定方法测定盐酸萘甲唑啉含量。测得平均含量为100.2%，RSD为0.15%，表明测定方法精密度良好。
2.2.2.4 回收率试验 分别称取本品约0.16、0.2、0.24g（分别相当于测定浓度的80%、100%、120%），各3份，精密称定，照“2.2.1”项下拟定方法测定盐酸萘甲唑啉含量并计算回收率，计算得低、中、高3中浓度的回收率分别为100.2%、100.3%、100.2；RSD分别为0.18、0.15、0.12，平均回收率为100.2%，RSD为0.15%。
2.3 两种方法测定结果的比较 分别用电位滴定法和高效液相色谱法测定3批盐酸萘甲唑啉原料药的含量，结果见表4。
表3.2.S.4.5-19 含量测定结果及限度制定依据
|
批号 |
HPLC法含量 |
电位滴定法含量 |
|
171028-1 |
100.6% |
100.5% |
|
171103-1 |
100.9% |
100.2% |
|
171110-1 |
101.5% |
100.4% |
3 讨论
3.1 电位滴定法 盐酸萘甲唑啉属于含氮杂环类盐酸盐类化合物，显酸性，可用强碱滴定，但酸碱反应后产生的游离碱（萘甲唑啉）不溶于水，因此本文选择乙醇作为溶剂，以增加萘甲唑啉的溶解性，并采用更为方便、准确的电位法指示终点，同时盐酸萘甲唑啉中可能含有部分游离盐酸，为减小测定误差，加0.01mol·L-1盐酸溶液5mL，两个突跃点体积的差作为滴定体积。
3.2 HPLC法色谱条件的选择 色谱条件的选择参考《美国药典》40中盐酸萘甲唑啉含量测定的方法，并对其进行适当的调整。减小流速，降低柱压，延长色谱柱的使用寿命。
3.3 小结 本文分别建立了电位滴定法和高效液相色谱法测定盐酸萘甲唑啉原料药含量，两种方法的测定结果均相差不大，均可用于盐酸萘甲唑啉含量测定。HPLC法相较于电位滴定法，专属性高，精密度好，使用样品量少，有利于环保，因此，建议采用HPLC法作为盐酸萘甲唑啉原料药的含量测定方法。
【参考文献】
[1] 盐酸萘甲唑啉中国药典2015年版二部质量标准：1072～1073
[2] 盐酸萘甲唑啉EP9.0标准：3122～3123
[3] 盐酸萘甲唑啉USP40. 标准：5279～5281
[4] 盐酸萘甲唑啉JP17标准：1289～1290
[5] 张晓平，高效液相色谱法测定盐酸萘甲唑啉含量[J].天津药学，1998，11（3）：53-54
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