UPLC-MS/MS法测定植物饮料中芦荟苷含量
林奕云，郑家概，付 强，丁少曼，肖可茵，卢嘉豪
（中国广州分析测试中心 广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070）
摘 要：建立了超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定植物饮料中芦荟苷含量的分析方法。样品用甲醇提取，采用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×50 mm，2.7
μm）为分离柱，以乙腈和水作为流动相，梯度洗脱。在电喷雾负离子模式下（ESI-），用多重反应监测（MRM）模式进行检测，基质匹配外标法定量。在优化的实验条件下，芦荟苷的检出限为1.0 μg/kg，定量限为3.0 μg/kg，线性范围为1.0~25 ng/mL，相关系数r≥0.9995。在5、10和25 μg/kg这3种加标水平下芦荟苷的平均回收率为91.2%~95.3%，相对标准偏差（RSD6）为3.15%~6.10%。该方法简单、灵敏度高、结果准确可靠，可用于植物饮料中芦荟苷含量的测定。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱法；芦荟苷；植物饮料
Determination
of Aloin in plant beverage by UPLC-MS/MS
LI Yi-yun，ZHENG Jia-gai，FU
Qiang，DING Shao-man，XIAO Ke-yin，LU Jia-hao
(Guangdong Provincial Public Laboratory of Analysis and
Testing Technology，China National Analytical Center Guangzhou，Guangzhou 510070，China)
Abstract:
A method was developed for
determination of Aloin in plant beverage using ultra performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Samples were extracted
with methanol.
The target analyte was separated on an Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 column (4.6
mm×50 mm, 2.7 μm) with gradient elution using acetonitrile and water as mobile
phases. Aloin was determined by multiple reaction monitoring (MRM) mode with
electrospray positive ion soure, and quantified by black matrix external
standard. Under the optimal experimental conditions, LOD of Aloin was 1.0
μg/kg, and LOQ was 3.0 μg/kg. The method showed a good linearity of Aloin in
the range of 1.0~25 ng/mL with
correlation coefficients more than 0.9995. The average recoveries for samples
spiked at three levels (5, 10 and 25 μg/kg) were ranged from 91.2% to 95.3%,
and the relative standard deviations (RSD6) from 3.15% to 6.10%.
This method was simple, sensitive, accurate and reliable, which could be
applied to the detection of Aloin in plant beverage.
Key words: Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Aloin;
Plant beverage
芦荟苷，又称芦荟大黄素苷或芦荟素，是芦荟的主要活性成分。芦荟不仅有抗炎、抗辐射等功效，还能够抗癌变、抗衰老、调节血糖[1-2]。近年来，随着人们健康养生意识的提高，植物饮料受到越来越多人的青睐，凉茶等天然植物饮料销量迅速增长[3]。以芦荟为原料的植物饮料的相关产品标准和法规尚未出台，只对植物饮料原辅料的要求中提到不得使用或添加非食品用原料[4-5]，然而，《欧盟食品中化学污染物限量规定》对饮料中芦荟苷的限值为0.1 mg/kg。因此，建立植物饮料中芦荟苷准确、灵敏的检测方法，具有重要的意义。
目前关于芦荟苷的检测方法有：分光光度法[6]、薄层扫描法[7]、液相色谱法[8-10]、液相色谱-串联质谱法[11-12]等。由于饮料中的芦荟苷含量很低，高效液相色谱-串联质谱联用法具有灵敏度高、专属性强等特点。因此，为有效监控芦荟苷在植物饮料中的含量，本文优化了液相色谱条件、质谱条件，建立了超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定植物饮料中芦荟苷含量的分析方法。该方法灵敏度高、回收率和重现性良好、结果准确可靠，可以检测植物饮料中低含量的芦荟苷，为控制产品质量提供数据及技术手段支持。
1 实验部分
1.1 仪器设备与试剂
Agilent 1290/6460A超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，美国安捷伦科技公司；Sartorius BSA224S 电子天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；XW-80A型微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器有限公司；KQ-2200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司。
芦荟苷（Aloin，CAS：1415-73-2，纯度：97.71%）购自成都普菲德生物技术有限公司；乙腈，色谱纯，美国Honeywell公司；甲醇，分析纯，购自广州化学试剂厂；实验用水为去离子水。
1.2 标准溶液配制
准确称取10.0 mg芦荟苷标准品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L的标准储备液，于4 ℃冰箱中避光保存。
1.3 样品前处理
称取样品5.0 g于25 mL棕色容量瓶中，加入15 mL甲醇，涡旋，混合均匀后超声提取10 min，冷却至室温，用水定容至25 mL，过0.22 μm滤膜上机测定。
1.4 基质匹配标准曲线的配制
称取5份空白基质样品，分别加入适量标准溶液，按照1.3进行处理，制成浓度为1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL的基质匹配标准工作液。
1.5 色谱/质谱测定条件
1.5.1 液相色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus
C18柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）；流动相A为乙腈，B为水；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量5.0 μL；梯度洗脱程序如下：0~3.0 min，40%~90%A，3.0~3.5 min，90%A，3.6~5.0 min，40%A。
1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），采用负离子电离模式，扫描方式为多反应监测模式（MRM）。干燥气温度为300 ℃，干燥气流量5 mL/min，雾化器压力40 psi，鞘流气温度350 ℃，鞘流气流量11 mL/min，毛细管电压3500 V。芦荟苷的MRM参数列于表1，安捷伦MassHunter软件用于定性和定量分析。
表1 芦荟苷的MRM参数
Table 2 MRM parameters of Aloin
|
化合物 |
母离子（m/z） |
子离子（m/z） |
保留时间（min） |
碎裂电压（V） |
碰撞能量（eV） |
|
芦荟苷 |
417.0 |
268.0 |
2.21 |
146 |
36 |
|
297.0* |
146 |
14 |
注：*表示定量离子对。
2
结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
分别以乙腈-水、甲醇-水作为流动相，考察对目标化合物离子化程度的影响。结果表明，以乙腈-水作为流动相时，芦荟苷的响应值明显高于流动相为甲醇-水时的响应值。因此，选用乙腈-水作为流动相。
目标化合物的离子化效率还会受到流动相中加入的添加剂影响[13]。比较在水相中分别加入0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸铵对目标化合物离子化效率的影响。结果发现，本实验水相中加入甲酸或乙酸铵，都抑制了离子化效率，芦荟苷响应值均有所降低，因此，试验采用乙腈-水作为流动相，进行梯度洗脱。
比较了Agilent Zorbax
Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）和SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）的分离效果。结果显示：Agilent Zorbax
Eclipse Plus C18柱的分离时间较短，芦荟苷峰形尖锐对称、不拖尾。
2.2 质谱条件的优化
使用1.0 μg/mL芦荟苷标准溶液进样，分别在ESI+、ESI-的模式下进行全扫描，扫描发现在负离子模式下，芦荟苷的灵敏度更高，因此，选择择负离子模式，m/z 417.0作为芦荟苷测定的母离子。采用SIM扫描方式，优化出最佳碎裂电压，146 V条件下，芦荟苷母离子的响应最高。再采用Product Ion扫描方式，芦荟苷经碰撞后产生的碎片离子有m/z 297.0 和m/z 268.0，其中m/z 297.0相对丰度最高，作为定量离子，m/z 268.0作为定性离子。最后，优化出子离子的最佳碰撞能量，得到表1所示的质谱参数。最终优化了质谱条件，得到如图1所示的芦荟苷标准溶液的MRM色谱图，如图2所示的阳性样品和阴性样品的总离子流TIC图。
图1 芦荟苷的多反应监测（MRM）色谱图
Fig.1 MRM Chromatograms of Aloin
图2 样品的总离子流（TIC）色谱图
Fig.2 TIC Chromatograms of
samples
2.3 线性范围
本文采用基质匹配外标法定量，以消除基质干扰，提高定量准确性。按照1.4配制基质匹配标准曲线，以芦荟苷的质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制工作曲线。结果表明，芦荟苷在1.0~25 ng/mL的质量浓度范围内线性回归方程为Y=5641.3X-265.5，相关系数r≥0.9995，具有良好的线性关系，表明该方法适用于植物饮料中芦荟苷的定量分析。
2.4 检出限和定量限
芦荟苷的的检出限为1.0 μg/kg（信噪比S/N=3），定量限为3.0 μg/kg（信噪比S/N=10）。
2.5 回收率和精密度
准确称取3份空白样品，每份5.0 g，加入芦荟苷标准溶液，添加量为5.0 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg，按照1.3方法进行样品处理。每个添加水平测定6次，考察方法的精密度。从表2可以看出，在5、10和25 μg/kg这3种加标水平下目标化合物的平均回收率为91.2%~95.3%，相对标准偏差（RSD6）为3.15%~6.10%，表明方法的准确度和重复性较好，可满足日常分析要求。
表 2
芦荟苷的回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 2 Spike recoveries and RSD of Aloin in blank samples (n=6)
|
化合物 |
加标量（μg/kg） |
平均回收率（%） |
RSD（%） |
|
芦荟苷 |
5 |
91.2 |
4.13 |
|
10 |
96.5 |
6.10 |
|
|
25 |
95.3 |
3.15 |
3 结论
本文建立了超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定植物饮料中芦荟苷含量的方法，样品经甲醇提取，基质匹配外标法定量，降低了基质干扰，提高了分析灵敏度。该方法灵敏度高、回收率和重现性良好、结果准确可靠，可以检测植物饮料中低含量的芦荟苷，为控制产品质量提供数据及技术手段支持，为植物饮料中非法添加非食品用原料的风险监测研究提供了可靠的检测手段。
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作者简介：林奕云(1988-)，女，广东汕头人，助理研究员，硕士，从事食品、保健品、饲料检测和研究。
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