五味子酯乙对肺癌耐紫杉醇A549/Tax细胞的多药耐药逆转作用及机制
刘小东，郑小红，张稳稳*
(重庆医药高等专科学校药学院，重庆市 401331)
[摘要]目的：研究探讨五味子酯乙对肺癌耐紫杉醇A549/Tax细胞的肿瘤多药耐药（MDR）逆转作用及机制。方法：MTT法检测分析五味子酯乙单独或联用阿霉素、紫杉醇对耐药A549/Tax细胞及其亲本敏感A549细胞的细胞毒性及MDR逆转作用，阿霉素蓄积实验和Pgp-GloTM Assay Systems分析检测五味子酯乙对P糖蛋白(P-gp)外排功能及 P-gp ATPase活性的影响，Westen blot检测分析A549/Tax细胞中P-gp和β-actin的蛋白水平。结果：五味子酯乙 (1.0、2.5、5.0 μmol/L) 剂量依赖性提高紫杉醇和阿霉素对P-gp过表达的A549/Tax细胞的抗增殖活性，激活P-gp ATPase活性并底物竞争性的抑制P-gp的药物外排转运功能，下调P-gp的过表达。结论:五味子酯乙通过底物竞争性抑制P-gp的药物外排功能和下调其蛋白水平有望在临床中克服P-gp过表达介导的MDR。
关键词:肿瘤多药耐药；P糖蛋白；五味子酯乙；外排功能
中图分类号：TK730.2；O357.5
Schisantherin B reverses
multidrug resistance of lung cancer A549/ Tax cells and its underlying mechanism
Liu Xiaodong, Zheng Xiaohong, Zhang
Wenwen*
(Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331, China)
[Abstract]
Objective: This study aimed
to evaluate the multidrug resistance reversal effect of schisantherin B in lung
cancer A549/Tax cells and its underlying mechanism. Methods: Cytotoxicity and reversal activity of schisantherin B in
A549/Tax cells and its parental A549 cells were measured by MTT assay. The
intracellular accumulation of p-glycoprotein (P-gp) substrate doxorubicin and ATPase activity of P-gp were
detected by flow cytometry and Pgp-GloTM assay systems. The
expression of P-gp and β-actin were determined by Western blot. Results: Results showed that schisantherin
B (1.0, 2.5, 5.0μmol/L) significantly enhanced the cytotoxicity of taxol and
doxorubicin in P-gp-overexpressed A549/Tax cells in a dose-dependent manner. It
also significantly increased intracellular doxorubicin accumulation and activiated
the P-gp ATPase activity. Moreover, schisantherin B significantly down-regulated
P-gp expression. Conclusion: These findings suggest that schisantherin B may be
a promising agent for overcoming P-gp-mediated MDR in clinic.
Keywords: multidrug
resistance; p-glycoprotein;schisantherin B; efflux function
肿瘤多药耐药(MDR)是肿瘤在治疗之初存在的和治疗过程中逐步形成的对多种结构和机制不相关的化疗药物产生耐药性的现象[1]，是肿瘤治疗过程中导致肿瘤进展、复发和转移的最常见的原因和最棘手的难题，已成为当前影响肿瘤治疗效果的主要因素和成功化疗的最大障碍之一[2]。
MDR的作用机理十分复杂，主要包括：药物外排泵ABC转运蛋白的过度表达，药物作用靶点的改变，DNA修复机制活性增强，药物解毒、消除酶的活性增强或表达增多，肿瘤细胞凋亡水平的异常，肿瘤干细胞等[3]。其中，药物外排泵P糖蛋白(P-gp)过量表达是目前研究最多，并在体外、体内研究中被广泛验证的经典的MDR机制[4]。
五味子为木兰科植物五味子或华中五味子的干燥成熟果实，主要药理活性成分为五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇乙等联苯环辛二烯型木脂素，具有保肝、抗氧化、提高免疫功能、改善认知功能和抗肿瘤等作用[5]。近年来，大量的研究报道五味子甲素、五味子丙素、五味子酯甲能通过抑制 P-gp或多药耐药相关蛋白1(MRP1)克服MDR, 而对五味子酯乙的研究目前少有报道[6-7]，本文旨在研究探讨五味子酯乙对肺癌耐紫杉醇A549/Tax细胞的MDR逆转作用及机制。
1.材料与方法
1.1 试剂
五味子酯乙为白色微灰粉末，纯度≥99.0%，DMSO配制使用。 MTT（货号: M8180)、紫杉醇（货号：IP0020）、阿霉素（货号：D8740）、RIRA裂解液（货号：R0010）、维拉帕米（货号：IV0040）、DMEM培养基（货号: 12100）、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（货号：T1300）购自索莱宝公司。青-链霉素溶液（货号：SV30010）、胎牛血清（货号：SH30084）购自美国HyClone公司。P-gp（货号：ab170904）一抗购自美国Abcam公司。IRDye680RD二抗（货号：925-68071）购自基因有限公司。β-actin（货号：sc-8432）一抗购自美国Santa
Cruz公司。Pgp-GloTM
Assay Systems试剂盒（货号：V3591）购自美国Promega公司。
1.2 细胞培养
人肺癌A549及其耐紫杉醇细胞株A549/Tax细胞用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL）-链霉素（100 μg/mL）的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱常规培养，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液化传代，A549/Tax在含0.02μmol/L 的紫杉醇的培养液中培养，取对数生长期细胞用于后续试验。
1.3
MTT分析
对数生长期A549细胞（1500个/孔）和A549/Tax细胞（3000个/孔）接种于96孔板，培养贴壁，梯度浓度的紫杉醇、阿霉素和/或五味子酯乙继续培养3 d，弃培养液，每孔加入0.5mg/mL MTT 100 μL的无血清培养液培养4 h，弃去MTT,
每孔加入DMSO 180 μL，充分震荡，酶标仪（Thermo，美国）570 nm波长测定OD值。细胞生长抑制率(%)=(1-药物处理OD值/对照组OD值）×100%。GraphpadPrism软件计算半数抑制浓度（IC50）。根据 IC50值计算耐药指数（RI）和耐药逆转倍数（FR），RI= IC50耐药细胞/ IC50亲本细胞；FR=IC50化疗药物/IC50化疗药物＋五味子酯乙。
1.4细胞内阿霉素蓄积分析
对数生长期A549/Tax细胞（1×106个/孔）接种于6孔板内，培养贴壁后，10 μmol/L 阿霉素单独或联合五味子酯乙继续培养4 h，收集细胞，PBS洗涤3次，流式细胞仪（BD，美国）检测荧光强度，蓄积倍数（FA）=荧光强度阿霉素＋五味子酯乙/荧光强度阿霉素。
1.5 P-gp
ATPase 活性分析
Pgp-GloTM Assay Systems检测分析五味子酯乙对P糖蛋白ATPase活性的影响。96孔化学发光板中，五味子酯乙或P-gp底物维拉帕米 (150
μmol/L) 37°C下作用重组人源P-gp细胞膜30
min，加入P糖蛋白ATPase特异性抑制剂钒酸钠（Na3VO4，150 μmol/L)和 MgATP（50 mmol/L），37℃孵育1h，加入25μL ATP检测试剂，继续孵育20 min。酶标仪(Thermo，美国)检测荧光信号强度。P-gp ATPase活性以荧光信号强度差值表示。
1.6
Western blot
RIRA裂解液冰上裂解药物处理的A549/Tax细胞15 min，4℃、12000 g离心10 min，收集细胞沉淀，提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，采用8%聚丙烯酰胺分离胶和5%浓缩胶进行电泳分离后湿法转移至PVDF膜上，室温封闭1.5 h后，将一抗用封闭液稀释至相应浓度（P-gp（1:1000），β-actin（1:5000）），将封闭后的膜在一抗TBST液中4℃杂交过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，将洗涤后的膜在二抗TBST工作液（1:10000）中，室温避光孵育2 h，TBST洗膜6次，每次5 min，Odyssey CLx成像系统检测和定量分析。
1.7 统计学方法
实验数据以
2. 结果
2.1 A549/Tax细胞过表达P-gp
Western
blot检测耐紫杉醇的A549/Tax细胞及敏感亲本A549细胞中P-gp的表达情况。如图1A所示， MDR表型的A549/Tax细胞中，P-gp的表达水平显著高于敏感亲本A549细胞（P＜0.01），而且P-gp的差异性表达与A549/Tax细胞的耐药指数密切相关，A549/Tax细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药指数高达20.3和11.5倍（表1），表明A549/Tax细胞的多药耐药表型是由P-gp的过表达引起的。
图1 （A）P-gp在耐药A549/Tax细胞及敏感亲本A549细胞中的差异化表达和（B）五味子酯乙对A549/Tax及A549细胞增殖的影响
2.2 五味子酯乙对紫杉醇和阿霉素抗A549/Tax细胞增殖活性的影响
MTT法检测五味子酯乙单独或联合紫杉醇、阿霉素处理对耐药A549/Tax细胞及敏感A549细胞的细胞毒性。如图1B所示，5.0 μmol/L浓度以下五味子酯乙单独作用时，A549/Tax和A549细胞的存活率均大于90%，因此在后续研究中使用非细胞毒浓度的五味子酯乙（1.0、2.5、5.0
μmol/L）。
如表1所示，五味子酯乙显著增强P-gp过量表达的多药耐药A549/Tax细胞对P-gp底物紫杉醇和阿霉素的抗肿瘤活性，且呈剂量依赖性，5.0 μmol/L五味子酯乙与紫杉醇和阿霉素联用的逆转倍数分别为11.6和13.8，恢复了耐药A549/Tax细胞对紫杉醇和阿霉素的敏感性（P＜0.01）。相反，五味子酯乙与紫杉醇和阿霉素联用不影响亲本A549对化疗药物的敏感性。这些结果表明五味子酯乙可增强MDR细胞对P-gp底物化疗药物的抗增殖活性，逆转P-gp过表达诱导的MDR。
表1 五味子酯乙对紫杉醇和阿霉素抗A549/Tax和A549细胞增殖活性的影响
|
化合物 (μmol/L) |
IC50 (μmol/L) (FR) |
|
|
A549/Tax （P-gp过表达） |
A549 |
|
|
紫杉醇 |
0.59±0.22 |
0.029±0.002 |
|
+五味子酯乙(1.0) |
0.095±0.037 (6.2) ** |
0.026±0.012(1.1) |
|
+五味子酯乙(2.5) |
0.073±0.008 (8.1) ** |
0.031±0.007(0.9) |
|
+五味子酯乙(5.0) |
0.051±0.012 (11.6) ** |
0.022±0.015(1.3) |
|
+维拉帕米(10) |
0.077±0.025 (7.7) ** |
0.029±0.006(1.0) |
|
阿霉素 |
0.94±0.14 |
0.082±0.002 |
|
+五味子酯乙(1.0) |
0.429±0.042 (2.2) * |
0.076±0.014 (1.1) |
|
+五味子酯乙(2.5) |
0.231±0.009 (4.1) ** |
0.089±0.023 (0.9) |
|
+五味子酯乙(5.0) |
0.068±0.005 (13.8) ** |
0.086±0.011 (1.0) |
|
+维拉帕米(10) |
0.086±0.003 (11.0) ** |
0.079±0.015 (1.0) |
注：与紫杉醇或阿霉素单独处理相比，*P < 0.05, **P
< 0.01
2.3 五味子酯乙对P-gp药物外排转运功能的影响
如图4A和B所示，与对照（1.0
μmol/L阿霉素单独处理3 h）相比，5.0 μmol/L五味子酯乙或10 μmol/L维拉帕米与阿霉素联合处理显著增加P-gp过表达的A549/Tax细胞内P-gp底物阿霉素的蓄积，5.0 μmol/L五味子酯乙和10 μmol/L维拉帕米联用的蓄积倍数（RA）值分别为4.3和3.9（P＜0.01），提示五味子酯乙与P-gp竞争性底物抑制剂维拉帕米相似，能抑制P-gp的药物外排功能，从而增加A549/Tax细胞内化疗药物浓度。
P-gp的药物外排转运功能与ATPase的水解作用相耦合, 因此进一步检测分析了五味子酯乙对P-gp ATPase活性的影响。如图2C所示，与P-gp竞争性底物维拉帕米（150 μmol/L）单独作用相似，5.0 μmol/L五味子酯乙可显著增加P-gp ATPase的活性（P＜0.01），且作用强于维拉帕米，提示五味子酯乙很可能也是P-gp的底物，在被P-gp外排转运时，消耗ATP，激活P-gp
ATPase活性。
图2 （A、B）五味子酯乙对A549/Tax细胞内阿霉素摄取和(C) P-gp ATPase活性增的影响, 与对照组相比， **
P < 0.01
2.4 五味子酯乙对P-gp蛋白水平的影响
Western
blot分析检测五味子酯乙对P-gp蛋白水平的影响。如图3A和B所示，5.0 μmol/L五味子酯乙处理A549/Tax细胞72 h能显著降低P-gp表达（P＜0.05），而10 μmol/L维拉帕米作用72 h对P-gp的水平无影响，表明五味子酯乙不仅抑制P-gp的药物外排功能，同时也能下调P-gp的表达，从而限制P-gp的活性，逆转A549/Tax细胞因P-gp过表达诱导的MDR。
图3 五味子酯乙对P-gp 表达的影响，与对照组相比，*P <
0.05
3.讨论
药物外排转运蛋白P-gp过表达诱导的MDR已成为恶性肿瘤成功化疗的主要障碍之一，临床中90%以上的化疗失败和复发与其相关，因此被作为临床肿瘤患者预后的评价指标之一[3,8]。P-gp具有广泛的底物谱，临床常用的化疗药物几乎都是其底物，近年来大量的研究旨在通过限制P-gp克服MDR[9]。本研究显示，P-gp在耐紫杉醇的A549/Tax细胞中的表达显著高于亲本敏感的A549细胞，并且P-gp的差异性高表达与耐药A549/Tax细胞对P-gp底物紫杉醇和阿霉素的耐药性密切相关，而非细胞毒性浓度的五味子酯乙与紫杉醇或阿霉素联用时能显著增强A549/Tax细胞对上述两种化疗药物的敏感性，表明A549/Tax细胞的多药耐药现象是由P-gp过表达引起的，五味子酯乙则展示出高效的MDR逆转作用。
P-gp 属于ATP 结合盒式结构超家族成员，是由MDR1基因编码的分子量约为170kD的磷酸糖蛋白。P-gp由两个同源性片段组成，每一片段又含有6个跨膜区和1个 ATP 结合区，具有ATP 依赖性的药物外排泵功能，能将药物泵出细胞膜外而降低胞内药物浓度[10]。小分子抑制剂或其它技术手段可通过抑制P-gp的药物外排转运功能和/或下调其蛋白表达水平克服其诱导的MDR[11-12]。本研究发现，五味子酯乙与P-gp竞争性底物抑制剂维拉帕米相似，能激活P-gp ATPase活性，底物竞争性抑制P-gp底物化疗药物阿霉素的外排转运功能。此外，本研究还发现五味子酯乙能显著降低耐药的A549/Tax细胞中P-gp的过表达，对P-gp的外排功能和蛋白表达进行双重抑制。
综上所述，作为中医临床常用药五味子的有效成分之一[13]，五味子酯乙通过抑制P-gp的药物外排功能和下调其蛋白表达，在体外能高效逆转肺癌耐紫杉醇A549/Tax细胞对多种化疗药物的耐药性，有望克服临床中P-gp过表达诱导的MDR，但仍需体内研究来进一步验证。
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基金项目：重庆市自然科学基金项目（cstc2018jcyjAX0722）；重庆市教委青年项目 (KJQN201802805，KJQN201902801)；重庆医药高等专科学校人才引进项目（ygz2018301）。
作者简介：刘小东，男，博士，从事肿瘤基础研究；通信作者：张稳稳，女，硕士，高级工程师，从事药物合成研究。
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