五味子酯乙通过下调Bcl-2表达增强内在耐药肝癌Bel7402细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性
刘小东，张稳稳，郑小红*
(重庆医药高等专科学校药学院，重庆市 401331)
[摘要]目的：研究探讨五味子酯乙对内在耐药肝癌Bel7402细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性的影响及机制。方法：MTT法检测顺铂、五味子酯乙单独或两药联用对Bel7402细胞增殖的影响，Hoechst 33258染色和DNA Ladder检测顺铂、五味子酯乙单独或两药联用对Bel7402细胞凋亡的影响，PI染色检测Bel7402细胞凋亡百分率和细胞周期变化，Westen blot检测Ble7402细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平。结果：低浓度顺铂（2.5μM）单独作用对Ble7402细胞增殖和凋亡无影响，五味子酯乙与低浓度顺铂联用后剂量依赖性增强对Ble7402细胞的抗增殖作用，诱导Ble7402细胞发生典型凋亡形态学特征变化，显著增加Ble7402细胞凋亡率和S期细胞占比，并显著上调活化Caspase-3水平和降低Bcl-2蛋白表达。结论:五味子酯乙与低浓度顺铂联用通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，增强内在耐药肝癌Bel7402细胞的凋亡敏感性。
关键词:凋亡；五味子酯乙；Bcl-2
中图分类号：
Schisantherin
B enhances the sensitivity of cisplatin
-induced apoptosis in intrinsic resistant human hepatic cancer Bel7402 cells by
down-regulating the expression of Bcl-2.
Liu Xiaodong, Zhang Wenwen , Zheng
Xiaohong *
(Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331, China)
[Abstract]
Objective: This study aimed
to evaluate the effect of schisantherin B on the sensitivity of cisplatin-induced
apoptosis in intrinsic resistant human hepatic cancer Bel7402 cells.
Methods: Cytotoxicity of cisplatin and schisantherin B alone or combination
treatment in Bel7402 cells was determined by MTT assay.
The effect of cisplatin and schisantherin B alone or
combination treatment on typical apoptotic morphology of Bel7402 cells was
assessed by Hoechst 33258 staining and DNA ladder assay. The percentage of apoptosis cells and cell cycle distribution
were measured by PI staining. The levels of caspase-3, Bax, Bcl-2 and β-actin
were detected by Western blot. Results: Low concentration of cisplatin (2.5μM)
alone treatment had no effect on the proliferation and apoptosis in Ble7402
cells, but combination treatment with schisantherin
B significantly enhanced the cytotoxicity of cisplatin in Ble7402 cells. Compared to cisplatin (2.5μM) alone treatment, co-administration
with schisantherin B also significantly indcued typical apoptotic characters of
Ble7402 cells: morphologic changes, DNA fragmentation and changes in cell cycle,
and significantly increased the level of active caspase-3 and down-regulated
the expression of Bcl-2. Conclusion: These results suggested that schisantherin
B could enhance the sensitivity of cisplatin-induced apoptosis in Bel7402 cells
by down-regulating the expression of Bcl-2.
Keywords: apoptosis;
schisantherin B; Bcl-2
在肿瘤治疗之初存在的和治疗过程中逐步形成的肿瘤多药耐药（MDR）是当前肿瘤临床治疗中面临的一大难题。MDR现象的机制众多，除药物外排泵ABC转运蛋白过表达等经典机理外，近年来，研究报道肿瘤干细胞、肿瘤免疫逃逸及药物诱导肿瘤细胞可塑性改变等新机制也参与了MDR[1]。凋亡和自噬是很多化疗药物最终发挥治疗作用清除肿瘤细胞的主要方式，化疗药物在治疗过程中的选择性压力和某些肿瘤细胞在治疗之初存在遗传因素能诱导凋亡信号通路紊乱，导致肿瘤细胞不能被有序清除，表现为对治疗剂量的化疗药物诱导的凋亡不敏感，只有使用更高甚至毒性剂量的药物才能发挥作用，因此肿瘤细胞凋亡缺陷和凋亡信号通路紊乱也是临床MDR的常见机制[2-3]。
五味子酯乙为五味子干燥成熟果实的主要药理活性成分之一[4]，早期研究发现五味子酯乙能通过抑制 P糖蛋白的表达和药物外排转运功能逆转多种耐药肿瘤细胞的MDR表型, 显著增强化疗药物的抗肿瘤活性，本文旨在研究评价五味子酯乙对顺铂诱导的内在耐药肝癌Ble7402细胞凋亡敏感的影响及其作用机制。
1.材料与方法
1.1 试剂
五味子酯乙为白色微灰粉末，纯度≥99.0%，DMSO配制使用。 MTT（货号: M2128)、顺铂（货号：P4394）、细胞裂解液（货号：C5914）、RPMI-1640培养液（货号:
R2405）、青-链霉素双抗（货号：V900929）、胰蛋白酶（货号：T1426）购自sigma公司。胎牛血清（货号：SH30396.03）购自HyClone公司。Caspase-3（货号：ab13847)、Bax（货号：ab53154）、Bcl-2（货号：ab182858）一抗购自Abcam公司。IRDye680RD二抗（货号：925-68071）购自基因有限公司。β-actin（货号：sc-8432）一抗购自Santa
Cruz公司。ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡检测试剂盒（货号: CA1050）、细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒（货号: G3680）购自索来宝公司
1.2 细胞培养
人内在耐药的肝癌Ble7402细胞用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL）-链霉素（100 μg/mL）的RPMI-1640培养液， 37 ℃、5% CO2
Thermo细胞培养箱培养，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化传代。
1.3 MTT
2×103个/孔对数生长期肝癌Ble7402细胞接种于96孔板，贴壁后，顺铂单独或联合五味子酯乙作用Ble7402细胞3 d，每孔加入0.5mg/mL MTT 120 μL的RPMI-1640培养液培养4 h，每孔加入DMSO
150 μL，充分震荡，酶标仪570 nm波长测定OD值。细胞生长抑制率(%)=(1-药物处理OD值/对照组OD值）×100%。
1.4 Hoechst 33258染色
1×106个/孔Bel7402细胞接种12孔板内，顺铂单独或联合五味子酯乙处理3 d后，弃培养液，PBS缓冲液洗涤3次， 500 μL/孔多聚甲醛PBS液固液孵育0.5 h，吸尽固定液，PBS缓冲液洗涤3次，500 μL/孔33258染液染色10 min，吸除染液，PBS缓冲液洗涤3次，倒置荧光显微镜观察拍照。
1.5 DNA Ladder
收集顺铂单独或联合五味子酯乙处理的Bel7402细胞后，加入细胞裂解液（1×106细胞/0.5 mL)，37℃消化24
h，每1×106细胞加入0.5mL
Tris苯酚，震荡混匀，低温10000 rpm离心10 min，取出酚相的上清液，加50 μL醋酸铵和0.5mL纯乙醇，震荡30 s，低温冻存60 min，4℃10000 rpm离心15 min，吸取上清液，加等体积75%乙醇，再10000 rpm离心15 min，之后加入60
μL TE液， a)每1毫升样品裂解液中加入5微升蛋白酶K，混匀。
b)对于上述收集好的样品，每5毫克组织或者106个细胞中加入500微升添加了蛋白酶K的样品裂解液，
Vortex混匀，充分裂解组织或细胞。
c)50水浴消化过夜(通常12-20小时皆可)。
d)加入500微升Tris平衡苯酚。
e)Vortex剧烈混匀，使有机相和水相充分混合，以达到抽提效果。4℃，12,000g离心5分钟。
f)缓慢吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积Tris平衡酚再抽提
一次(同步骤e)。
g)缓慢吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积氯仿再抽提一次
(同步骤e)。
h)慢慢吸出约300微升上清液，加入60微升10M醋酸铵和600微升无水乙醇，颠倒数次混匀，此时可见DNA沉
淀产生。-20冻存1小时，以充分沉淀小片断DNA。冻存过夜或-70℃冻存效果更佳。
i)4，12, 000g 离心10分钟，弃上清。
j)加入600微升70%乙醇，轻轻颠倒约2次。4℃，12, 000g 离心10分钟，小心吸去上清。注意：70%乙醇
洗涤的时候，千万注意避免损失一些细小的DNA沉淀，这些沉淀中大部分是你所需的DNA ladder。
k)尽量吸除残余的乙醇，待看不到明显的液体时，立即加入50-100微升TE溶解DNA。注意：不可过分干燥
基因组DNA沉淀，否则会极难溶解。如果发现DNA沉淀难以溶解，可以在4用摇床缓慢摇动过夜，以溶
解DNA沉淀。1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像检测DNA Ladder。
1.6 PI染色
收集顺铂单独或联合不同浓度五味子酯乙处理72 h的细胞，1×PBS 2000g洗3次，75％的乙醇孵育24
h，再离心洗涤一次，用含50mg/L
RNase PBS液
1.7 Western blot
RIRA裂解液冰上裂解顺铂单独或联合不同浓度五味子酯乙处理Bel7402细胞10 min，4℃、15000 g离心20 min，提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，采用10%聚丙烯酰胺分离胶和5%浓缩胶进行电泳，湿法转膜，室温封闭90 min，封闭后的PVDF膜在一抗TBST液（Caspase-3（1:500），β-actin（1:3000），Bax（1：2000）、Bcl-2（1：1500），将在一抗中4℃孵育过夜，TBST洗膜3～6次，5 min/次，二抗TBST工作液（1:11000）室温避光孵育1 h，TBST洗膜3～6次，5 min/次，Odyssey CLx成像系统检测分析。
1.8 统计学方法
数据以
2. 结果
2.1 五味子酯乙增强顺铂对内在耐药的肝癌Bel7402细胞的抗肿瘤活性
如图1A所示，内在耐药的肝癌Bel7402细胞对低浓度顺铂不敏感，顺铂（≤2.5μM）单独作用72 h对Ble7402细胞的增殖无影响（存活率均大于90%）。但与非细胞毒性浓度五味子酯乙（1.0、2.5、5.0
μM）联用时，可显著以抑制Bel7402细胞的增殖（P < 0.05, P
< 0.01），且抗增殖作用与五味子酯乙浓度呈剂量依赖性（图1B），表明五味子酯乙可剂量依赖性增强顺铂对内在耐药的Ble7402细胞的抗肿瘤活性。
图1（A）顺铂、五味子酯乙单用和（B）顺铂与五味子酯乙联用对Bel7402细胞增殖的影响, 与对照组相比，*P < 0.05, **P
< 0.01。
2.2五味子酯乙增强顺铂诱导的Bel7402细胞凋亡的敏感性
如图2A和B所示，正常细胞核结构完整、染色均匀，顺铂（2.5
μM）和五味子酯乙（5.0μM）单独作用72
h，Bel7402细胞核形态没有发生变化，而五味子酯乙与顺铂联用后，Bel7402细胞核出现典型的凋亡特征性变化（图2A），且凋亡细胞的百分率显著升高（P < 0.01）。此外，如图2C所示，顺铂（2.5
μM）和五味子酯乙（5.0μM）单独作用72
h，
未诱导Bel7402细胞出现DNA
片段化条带，而两药联用可观察到典型凋亡特征性片段化条带。这些结果表明五味子酯乙能增强Bel7402细胞对烷化剂顺铂诱导凋亡的敏感性，表现出典型的凋亡形态学特征性。
图2（A、B）Hoechst
33258染色和（C）DNA
Ladder检测顺铂、五味子酯乙单用或两药联用对Bel7402细胞凋亡的影响, 与对照组相比，**P < 0.01。
2.3五味子酯乙与顺铂联用对Bel7402细胞周期的影响
如图3A和B所示，顺铂（2.5
μM）和五味子酯乙（5.0μM）单独作用72
h，Bel7402细胞未发生凋亡，细胞周期无变化，而五味子酯乙与顺铂联用后，细胞凋亡率显著提高（P < 0.01），细胞周期中各期细胞的百分比显著变化，其中G0/G1期细胞占比明显减少（P < 0.05），而S期细胞的百分比则显著增加（P < 0.01）。这些发现进一步提示五味子酯可显著增强Bel7402细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性，并影响细胞周期。
图3五味子酯乙与顺铂联用对Bel7402凋亡率和细胞周期的影响，与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。
2.4五味子酯乙与顺铂联用对Ble7402细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2水平的影响
如图4所示，顺铂（2.5
μM）和五味子酯乙（5.0μM）单独作用72
h，Bel7402细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平均无变化，而五味子酯乙与顺铂联用后，活化的Caspase-3蛋白水平显著提高（P < 0.01），但抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著降低（P < 0.05），提示五味子酯乙与顺铂联用后显著降低Bcl-2水平，使得Bax与Bcl-2的比值显著升高，进而激活Bel7402细胞内的凋亡效应激酶Caspase-3，诱导Bel7402凋亡。
图4五味子酯乙与顺铂联用对Ble7402细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2水平的影响，与对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。
3.讨论
肿瘤细胞由于遗传因素或化疗药物等外源因素诱导凋亡缺陷而导致的肿瘤多药耐药是肿瘤治疗中面临的一大难题。肿瘤细胞凋亡的调控非常复杂，凋亡通路中的抗凋亡蛋白过表达、促凋亡因子低表达或失活等因素的独立或联合作用，常诱使肿瘤细胞对多种临床常用药物凋亡敏感性显著降低，进而形成MDR [5]。所以以紊乱的凋亡通路调控因子（如Bcl-2、Bax、XIAP、IAPs、caspases、p53、蛋白酶体、NF-κB和特异性激酶等）为靶点克服MDR是可行的治疗策略[6]。本研究中，无毒浓度五味子酯乙剂量依赖性增强化疗药物顺铂对内在耐药的肝癌Ble7402细胞的细胞毒性，恢复Ble7402细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性，逆转了内在耐药的肝癌Ble7402的MDR表型。
Bcl-2家族蛋白主要分为两大类：抗凋亡蛋白Bcl-2等，促凋亡蛋白Bax等及BH3结构域蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例平衡和位置变化在肿瘤细胞凋亡缺陷机制中发挥非常重要的作用[7-8]。寡聚化的Bax等可在线粒体外膜形成孔道，允许细胞色素C等释放到胞浆中级联激活内源性凋亡通路，而抗凋亡的Bcl-2能中和Bax，阻止线粒体膜通透性增加（MOMP），抑制线粒体膜细胞色素C等的释放[9-10]。研究报道，某些肿瘤，如乳腺癌中，Bcl-2蛋白过表达[11]；而另外一些肿瘤中，如血液肿瘤中则发现Bax低表达 [12]。本研究中，五味子酯乙与顺铂联合作用显著降低G0/G1期细胞、增加S期细胞，且显著下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平，使得Bax与Bcl-2的比值显著升高，进而激活Bel7402细胞内的凋亡效应激酶Caspase-3，Bel7402凋亡显著增加。
综上所述，五味子酯乙不仅能抑制P糖蛋白的外排功能和表达，还能下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，恢复了促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的平衡，进而促进MOMP，激活内源性凋亡通路，增强内在耐药肝癌Bel7402对顺铂诱导的凋亡的敏感性，克服凋亡缺陷而逆转MDR，为五味子酯乙的进一步研究提供了新的理论依据。
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基金项目：重庆市自然科学基金项目（cstc2018jcyjAX0722）；重庆市教委青年项目 (KJQN201802805，KJQN201902801)；重庆医药高等专科学校人才引进项目（ygz2018301）。
作者简介：刘小东，男，博士，肿瘤基础研究；通信作者：郑小红，女，博士，副教授，肿瘤基础研究。
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