摘要：目的：探讨中药富硒酵母复合物的功能作用。方法:用一定量的中药富硒酵母复合物饲养小鼠，通过免疫功能试验、抗疲劳实验判定中药富硒酵母复合物的功能作用。结果:免疫功能试验中，中药富硒酵母复合物能提高脾淋巴细胞转化能力和血清溶血素水平，增加抗体生成细胞数；小鼠抗疲劳实验中，中药富硒酵母复合物小鼠负重游泳时间和运动时肝糖原储备量明显增加；运动时血清尿素氮生成及血乳酸曲线下面积明显减少。结论:中药富硒酵母复合物有增强免疫力、抗疲劳作用。
关键词：小鼠，增强免疫，抗疲劳
硒作为人体和动物活动的必需微量元素，可有效预防多种疾病的发生[1]。硒酵母作为一种有机硒，近年来发展迅速，关于其增强免疫力、缓解机体疲劳、抗氧化等作用研究报道日益增多。本实验以富硒酵母为原料，复配其他中药活性成分，考察该复合物功能作用，并对其毒性作用进行了初步研究。
一、实验材料
1.1受试物：受试物中药富硒酵母复合物主要由灵芝孢子粉、枸杞提取物（水煎煮提取）、富硒酵母（硒含量为0.05%）等组成。受试物人体推荐量为每人每日5g/60kg.bw，即灵芝孢子粉3.6g/60kg.bw、枸杞提取物0.18g/60kg.bw、富硒酵母0.14g/60kg.bw。
1.2实验动物：选用健康SPF昆明种雌雄性小鼠，体重为18g～22g，SPF级Wistar雌雄性大鼠，体重为180g～220g，均由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。
二、毒理学实验研究
2.1 小鼠急性毒性试验：实验称取小鼠20只，雌雄各半，采用最大耐受量（MTD）试验，小鼠空腹16h后，间隔4h，取一定量的受试物，用蒸馏水溶解定容至一定浓度，以0.20mL/10g.bw容量灌胃2次，总剂量为20.0g/kg.bw，连续观察14天，观察并记录小鼠的中毒表现及死亡情况。
表1 受试物对小鼠的急性毒性试验结果（
）
动物 品种 | 性别 | 初始体重 （g, | 7天体重 （g, | 14天体重 （g, | 途径 | MTD (g/kg.bw) |
小鼠 | 雄 | 18.89±0.80 | 26.94±1.13 | 32.92±1.97 | 经口 | >20.0 |
雌 | 19.31±0.65 | 25.02±1.07 | 28.92±1.91 | 经口 | >20.0 |
实验结果显示，以20.0g/kg.bw剂量给予小鼠灌胃，14天观察期内未见小鼠有明显的中毒症状，亦无死亡。试验结束后处死小鼠，解剖观察主要器官，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺、胃、肠等均未见明显异常改变。受试样品对两种性别小鼠的最大耐受剂量（MTD）均大于20.0g/kg.bw。
2.2大鼠30d喂养试验：实验分别称取一定量的受试物,用蒸馏水配制至100mL，灌胃量为2.08g/kg.bw、4.17/kg.bw、8.33g/kg.bw，分别相当于人体每日推荐量的25倍、50倍、100倍，以1.0mL/100g.bw体积进行灌胃。阴性对照组灌服等体积蒸馏水。单笼喂养，自由饮食，连续30天。每天观察动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周体重并记录食物摄入量，计算每周及总的食物利用率。给予受试物30天后，处死大鼠，进行血液学指标、血清生化学指标检测。并对所有动物进行大体检查，脏器称重，计算相对重量（脏/体比值），并进行病理组织学检查（肝、肾、脾、胃及十二指肠、睾丸或卵巢）。
表2受试物30天喂养试验血液学检查结果（
，n=10）
性别 | 剂量 （g/kg.bw） | 白细胞计数 （×109/L） | 淋巴 （%） | 单核 （%） | 粒细胞 (%) | 红细胞计数 （×1012/L） | 血红蛋白 （g/L） | ||
雄 | 阴性对照 | 9.53±2.52 | 72.83±11.97 | 9.23±2.57 | 17.93±9.66 | 7.13±0.42 | 158.30±10.69 | ||
2.08 | 9.62±2.37 | 79.30±7.98 | 8.53±2.83 | 11.97±5.43 | 6.91±0.24 | 153.00±9.36 | |||
4.17 | 9.15±1.68 | 78.46±7.95 | 8.15±1.95 | 13.38±6.24 | 6.97±0.72 | 156.90±19.09 | |||
8.33 | 9.17±1.23 | 79.13±9.27 | 7.31±2.07 | 12.86±6.58 | <, td width="87" valign="top" style="width:65.8000pt;padding:0.0000pt 5.4000pt 0.0000pt 5.4000pt ;border-left:none;
border-right:none;border-top:none;border-bottom:none;">151.50±10.93 | ||||
雌 | 阴性对照 | 7.33±1.35 | 76.95±16.92 | 7.41±2.45 | 15.64±14.83 | 7.28±0.61 | 158.40±11.60 | ||
2.08 | 7.92±1.92 | 74.94±7.55 | 9.63±2.50 | 15.43±5.18 | 7.06±0.42 | 155.70±8.76 | |||
4.17 | 7.61±1.80 | 79.25±8.20 | 7.80±2.21 | 12.95±6.07 | 7.12±0.59 | 158.80±16.09 | |||
8.33 | 7.24±1.73 | 80.50±5.52 | 7.67±1.45 | 11.81±4.49 | 7.12±0.82 | 158.80±16.91 | |||
与阴性对照组相比无显著性差异（P>0.05）
表3受试物30天喂养试验生化检验结果（
，n=10）
性别 | 剂量组(g/kg.bw) | 血糖 (mmol/L) | 尿素氮 (mmol/L) | 肌酐 (μmol/L) | 谷丙转氨酶 (U/L) | 谷草转氨酶 (U/L) | 总蛋白 (g/L) | 白蛋白 (g/L) | 甘油三酯 (mmol/L) | 胆固醇 (mmol/L) |
雄 | 阴对照 | 5.76±0.92 | 8.76±1.40 | 50.03±8.15 | 44.53±6.90 | 146.91±14.70 | 69.10±7.71 | 39.02±6.65 | 1.03±0.20 | 1.75±0.20 |
2.08 | 5.92±0.74 | 8.41±1.12 | 47.56±6.56 | 41.39±7.28 | 151.46±16.02 | 67.84±4.09 | 38.52±4.28 | 1.04±0.12 | 1.80±0.15 | |
4.17 | 5.56±0.60 | 8.93±0.86 | 48.51±4.34 | 43.43±4.61 | 149.91±5.92 | 68.03±6.58 | 37.24±4.77 | 1.00±0.11 | 1.82±0.16 | |
8.33 | 5.64±0.78 | 8.65±0.97 | 54.44±7.58 | 45.78±7.43 | 143.35±16.20 | 71.73±8.94 | 39.97±5.20 | 1.07±0.11 | 1.77±0.12 | |
雌 | 阴对照 | 5.54±0.75 | 8.18±1.48 | 46.55±7.26 | 44.33±7.69 | 147.05±13.46 | 66.48±8.22 | 36.54±5.86 | 1.00±0.11 | 1.74±0.18 |
2.08 | 5.67±0.82 | 8.62±1.11 | 48.35±5.10 | 40.84±7.72 | 150.67±11.58 | 68.18±7.85 | 37.95±4.38 | 1.05±0.15 | 1.79±0.15 | |
4.17 | 5.33±0.70 | 8.21±1.27 | 43.92±7.86 | 46.02±6.78 | 145.32±15.69 | 70.28±6.48 | 37.18±6.83 | 1.01±0.12 | 1.73±0.18 | |
8.33 | 5.76±0.74 | 7.75±1.36 | 47.79±4.32 | 43.60±6.40 | 151.61±11.30 | 67.79±4.83 | 35.84±6.75 | 1.07±0.12 | 1.74±0.22 |
与阴性对照组相比无显著性差异（P>0.05）
实验结果显示，连续以人体每日推荐量的25倍、50倍、100倍受试物经灌胃给予大鼠30天，各剂量组动物体重、体重增加、进食量及食物利用率与阴性对照组相比均无显著性差异（P>0.05），血液学指标、血生化指标、脏器绝对重量及脏/体比值与阴性对照组相比无显著差异（P>0.05），病理组织学检查，证实受试物对受检脏器无明显损害。
三、功能作用试验研究
功能实验均参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）进行。
3.1动物分组：增强免疫实验：实验选用雌性小鼠120只，分为3个免疫大组，每大组40只，免疫大组小鼠分为水对照组、低、中、高剂量4组，每组各10只。
缓解体力疲劳实验：试验根据小鼠体重、血尿素、负重游泳时间、肝糖原和血乳酸含量数据，将小鼠随机分为4大组，每大组再设置对照组，低、中、高剂量组4小组，每组10小鼠。
3.2实验材料：
试剂：RPMI1640培养液、小牛血清、2-MA、青霉素、链霉素、刀豆蛋白、盐酸、异丙醇、MTT、Hank’s液（pH7.2-7.4）、CRBC、补体（豚鼠血清）、生理盐水、琼脂糖、乳酸锂、尿素氮、肝糖原、血乳酸检测试剂盒等。
仪器：200目筛网、24孔和96孔平底细胞培养板、无菌手术器械、二氧化碳培养箱、755分光光度计、洁净工作台、高压灭菌器、无菌滤器、微量注射器（25ul）、游标卡尺、恒温水浴、玻片架、天平、铅皮、电动玻璃匀浆器、低速离心机、分光光度计、游泳箱、恒温水浴锅、玻璃器皿、一次性定量取血管、试管、离心管、微量加样器、手术器械等
3.3受试物给予方式和实验方法：实验各组小鼠每日受试物食用剂量为0.42g/kg.bw、0.83g/kg.bw、2.5g/kg.bw，分别人体推荐量的5倍、10倍、30倍。小鼠经口每日一次灌胃给予受试物，灌胃体积按20mL/kg.bw。对照组以等体积的生理盐水灌胃，连续给予30d后分别测定免疫功能、缓解体力疲劳功能的各项指标。
3.4结果统计：用SPSS软件进行数据处理，采用方差分析。
四、结果
表4受试物对小鼠细胞免疫功能的影响实验
组别 | 足跖厚度差（mm） | 淋巴细胞增殖能力（OD差值） |
对照组 | 0.30±0.05 | 0.365±0.058 |
低剂量组 | 0.31±0.03 | 0.363±0.077 |
中剂量组 | 0.32±0.04 | 0.456±0.048** |
高剂量组 | 0.32±0.08 | 0.452±0.020** |
与对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01，下同
由表4可见，连续给予小鼠不同剂量受试物30d，各剂量组小鼠的足跖肿胀度与对照组比较无显著性差异（P＞0.05），中、高剂量组小鼠的淋巴细胞增殖能力均高于对照组，比较存在显著性差异（P<0.01）。
表5受试物对小鼠体液免疫功能的影响实验
组别 | 溶血空斑数（×103个脾细胞） | 半数溶血值（HC50） |
对照组 | 45.3±9.5 | 70.9±7.8 |
低剂量组 | 54.9±7.6* | 76.8±8.0 |
中剂量组 | 47.3±10.7 | 78.7±6.6* |
高剂量组 | 53.1±8.7 | 79.5±8.1* |
由表5可见，连续给予小鼠不同剂量受试物30d，低剂量组小鼠的抗体生成细胞数高于对照组，比较有显著性差异（P<0.05）；中、高剂量组小鼠的血清溶血素水平均高于对照组，比较有显著性差异（P<0.05）。
表6受试物对小鼠NK细胞活性的影响
组别 | NK细胞活性（%） |
对照组 | 31.4±6.0 |
低剂量组 | 33.2±8.1 |
中剂量组 | 34.4±6.5 |
高剂量组 | 35.2±8.0 |
由表6可见，连续给予小鼠不同剂量受试物30d，低、中、高剂量组小鼠的NK细胞活性与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。
表7受试物对小鼠负重游泳时间的影响（
±s）
组 别 | 游泳时间（min） | 尿素（mmol/L） | 肝糖原（mg/100g） |
对 照 组 | 25.99±8.18 | 8.03±0.74 | 1477.20±123.36 |
低剂量组 | 29.89±7.34 | 7.93±1.02 | 1508.78±109.25 |
中剂量组 | 34.03±10.09 | 7.86±1.06 | 1654.59±165.03* |
高剂量组 | 38.14±9.75* | 6.42±0.74** | 1735.86±176.41** |
由表7可见，连续给予小鼠不同剂量受试物30d，高剂量组小鼠的负重游泳时间明显高于对照组，比较差异性显著（P<0.05），小鼠血清尿素含量明显低于对照组，比较差异有显著性（P<0.01）；中、高剂量组小鼠肝糖原含量明显高于对照组，比较差异性显著（P<0.05，P<0.01）。
表8受试物对小鼠三个时间点血乳酸含量的影响（
±s）
组 别 | 游泳前（mg/L） | 游泳后0min（mg/L） | 游泳后休息20min（mg/L） |
对 照 组 | 428.65±63.05 | 805.54±83.62 | 753.29±99.44 |
低剂量组 | 408.82±68.51 | 794.41±55.90 | 733.93±69.93 |
中剂量组 | 415.59±58.48 | 725.71±95.16* | 674.91±44.82* |
高剂量组 | 410.75±60.49 | 707.32±40.40** | 640.07±77.44** |
由表8可见，连续给予小鼠不同剂量受试物30d，游泳前小鼠血乳酸含量与对照组比较，无显著性差异（P>0.05）。小鼠游泳后休息0min 、20min的血乳酸含量均低于对照组，比较差异有显著性（P<0.05，P<0.01）。
表9受试物对小鼠3个时间点血乳酸曲线下面积的影响（
±s）
组 别 | 血乳酸曲线下面积 |
对 照 组 | 21759.16±2072.54 |
低剂量组 | 21299.54±1333.33 |
中剂量组 | 19712.66±1474.86** |
高剂量组 | 19064.36±1406.16** |
由表9可见，连续给予小鼠不同剂量受试物30d，中、高剂量组小鼠3个时间点的血乳酸曲线下面积明显小于对照组，比较有显著性差异（P<0.01）。
以上实验表明，经口给予小鼠不同剂量的中药富硒酵母复合物，受试物能提高脾淋巴细胞转化能力和血清溶血素水平，增加抗体生成细胞数；对小鼠的足跖肿胀度、促进NK细胞活性无明显影响。小鼠负重游泳时间和运动时肝糖原储备量明显增加；运动时血清尿素氮生成量及血乳酸曲线下面积明显减少。根据《保健食品检验与评价技术规范》判定标准，受试物具有一定的增强免疫力和缓解体力疲劳功能。
五、讨论
硒作为一种重要的微量元素，参与机体的多种生命活动，例如参与过氧化物自由基的分解和自由基的清除，参与辅酶A和辅酶Q的合成，增加机体糖代谢和生物氧化作用等等。研究中不乏硒具有增强免疫力和抗疲劳作用的报道，如：姜帆[2]以左旋甲状腺素联合硒酵母为临床用药治疗淋巴细胞性甲状腺炎，并报道了硒在机体内主要以硒蛋白状态存在，能有效增强淋巴细胞的生长增殖，具调节免疫的功效作用。朱琳等[3]报道了癌症患者在放化疗期间补充硒,可提高患者T细胞亚群和免疫球蛋白数量，说明在一定程度上补充硒可提高免疫系统的功能,减轻不良反应的发生。李慧等以用一定量的富硒蒜饲养小鼠一段时间，显示富硒蒜组能明显延长小鼠负重游泳时间,显著增加小鼠肝糖原含量,减少小鼠运动前后血乳酸曲线下面积，具有缓解机体体力疲劳的作用[4]。夏正东等[5]报道了硒对可通过提高机体抗氧化、有氧化代谢能力达到抗疲劳的作用。
本研究首先通过急性毒性试验和30天喂养试验确定灵芝孢子粉、枸杞子提取物、硒酵母配伍安全性，为探究三者功能作用提供安全性依据。功能实验表明，经口给予小鼠不同剂量的中药富硒酵母复合物样品，能提高脾淋巴细胞转化能力和血清溶血素水平，增加抗体生成细胞数；还能增加小鼠负重游泳时间和运动时肝糖原储备量，减少运动时的血清尿素氮生成量及血乳酸曲线下面积。实验证实，以灵芝孢子粉、枸杞子提取物配伍富硒酵母具有增强免疫力、抗疲劳作用。其中原料灵芝孢子粉、枸杞子提取物中均含有丰富的多糖成分[6-7]，具有增强免疫力、抗疲劳、抗氧化等多种生物功效[8-9]，二者与硒酵母配伍，功效协同。随着科技的进步，富硒中药产品的开发和应用扩大，对充分利用我国中药资源，开发研究新药，治疗各种未治病等有重大作用。
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[5]夏正东，王振富，钟灵，等.富硒板党抗疲劳和抗缺氧作用的实验研究.中国应用生理学杂志[J].2014,30（2）：156-158。
[6]冯鹏，沈建，刘诚，等灵芝孢子多糖胶囊增强免疫力的研究.时珍国医国药[J].2007,18（12）：3039-3040
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