HPLC测定左旋龙脑

　　

HPLC-RID法测定艾片中左旋龙脑含量

马海霞¹、杨广安、陈敏¹、谭琪明¹、何珺^1,2*

（1.铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300;2.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025）

( 1．Tongren Polytechnic College，Tongren 554300,China; 2.Biochemistry Engineering Center of Guizhou Province, Guiyang 550025, China )

摘要：目的：采用高效液相色谱仪测定艾片中左旋龙脑含量。方法：采用HPLC-RID法测定艾片中左旋龙脑含量，色谱条件：色谱柱：依利特C18柱；检测器：示差检测器；柱温：40 ℃；检测温度：35℃；流动相：甲醇或乙腈—0.4%磷酸溶液（65:35）；流速：1.0 mL/min。结果：左旋龙脑溶液在0.207~1.554 mg/mL范围内峰面积与浓度线性关系良好，回归方程为：Y=78694X+3011.5 ( R=0.9992，n=7)，平均添加回收率为101.01 %（RSD=1.02%），精密度 RSD为1.14 %，稳定性RSD为0.60%，结论：该方法灵敏度高，简便、快捷、有效，具有较好的精密度和重现性，可用于艾片艾片中左旋龙脑含量。

关键词：艾片、左旋龙脑、HPLC-RID法

Abstract: Objective: To determine the content of levorneborneol(L-Borneol) in Natural Borneol by HPLC. Methods: HPLC-RID method was used to determine the content of levornol in Natural Borneol. The HPLC chromatographic conditions included Hypersil C18 column (150mm×4.6mm, 5μm), 65% methanol-0.4% phosphoric acid solution at the flow rate 1.0mL/ min of the mobile phase, the column temperature was controlled at 40 ℃ and refractive index detector (RID) was used. Results: The linear ranges of L-Borneol was 0.207~1.554 mg/mL. The regression equation are Y=78694X+3011.5 ( R=0.9992，n=7). The average recovery rate (n=6) of L-Borneolvwas 101.01 % (RSD=1.02%). Conclusion: The HPLC-RID method is precise, reproducible and stable, which can be applied in the quality control of Natural Borneol.

Key words: L-Borneol; Natural Borneol; HPLC-RID

作者简介：马海霞（1989-），女，汉族，籍贯（山东省曹县人），讲师，硕士研究生，硕士学位，铜仁职业技术学院教师，主要研究方向：天然药物提取分离纯化与质量控制。

基金项目：铜仁职业技术学院 专项研究 “艾纳香挥发油提取工艺优化及主要活性成分探究”（【2020】121号）；铜仁职业技术学院民族特色药用资源开发与应用创新团队（铜职院办发【2020】118号）；铜仁职业技术学院 专项研究 黔东民间特色药用植物调研（【2020】121号）。

艾片为菊科植物艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC.的新鲜叶经提取加工制成的结晶，艾纳香属植物（Blumea oblongifolia）全草含生物碱、炔烃类、甾醇、黄酮类、挥发油等^[1,2]。《本草纲目》等有记载：“辛、苦，微寒。归心、脾、肺经。功效主治：开窍醒神，清热止痛。用于热病神昏、痉厥，中风痰厥，气郁暴厥，中恶昏迷，目赤，口疮，咽喉肿痛，耳流脓疮。”艾片临床应用极为广泛，尤其在心脑血管疾病的预防和治疗中，是开窍醒神的常用中药，能够很好的提高药物的生物利用度^[3-5]。《中国药典》2015版收录艾片（左旋龙脑）含量测定方法为气相色谱法（GC）^[7,8]，气相色谱法对艾纳香、艾纳香挥发油及艾片等进行了较为详细的成分分析用于艾纳香油的质量控制。目前，除了GC法外，国内有效检测左旋龙脑含量的方法报道较少^[9,10]。因此，建立准确、简便左旋龙脑含量的方法具有非常重要的意义。该实验通过建立高效液相色谱测定艾片中左旋龙脑的含量，该方法简便、专属、准确，适用于工业化生产的快速测定。

1 实验试剂和仪器

对照品: 左旋龙脑 ( 购于中国药品生物制品检定所， 批号: 111683—200604 )，供含量测定用。样品: 艾粉样品 ( 购自贵州省罗甸县)。试剂: 甲醇 ( 色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司) ; 磷酸 ( 分析纯，贵阳高新技术开发区华通化学试剂厂) ; 娃哈哈饮用纯净水: 贵阳娃哈哈饮料有限公司制造; 其他试剂均为分析纯。

仪器: 分析型HPLC：（1100 series） Agilent Technology，U.S； C18高效液相色谱柱（大连依利特分析仪器有限公司）；BSA124S 电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；SG2200HE 超声波清洗器（上海冠特超声仪器公司）；其他为一般常规仪器。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：依利特C18柱；检测器：示差检测器；柱温：40℃；检测温度：35℃；流动相：甲醇或乙腈—0.4%磷酸溶液（65:35）；流速：1.0 mL/min

2.2 溶液的制备

样品溶液制备：艾纳香粗晶经抽滤初步除去多余水分，石油醚溶解并加入足量的无水硫酸镁充分搅拌，过滤，滤液旋干，得艾纳香晶体，称量10 mg，加10mL甲醇，溶解制备得1 mg/mL样品溶液，为供试品溶液；

左旋龙脑对照品溶液制备：取左旋龙脑对照品10 mg，精密称定，加甲醇制成1 mg/mL溶液，作为对照品溶液；

混合对照品溶液的制备：分别取左旋龙脑、左旋樟脑、异龙脑对照品10 mg，精密称定，加甲醇制成1 mg/mL的混合溶液，作为混合对照品溶液。

2.3 系统适应性试验

测定方法：精密量取溶液1 mL 置 10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀。分别取左旋樟脑、左旋龙脑、异龙脑的标准品溶液、混合标准品溶液及样品溶液各10 μL注入高效液相，进行HPLC分析，记录色谱图，见图1。

图1：高效液相色图分别为左旋樟脑（A）、左旋龙脑（B）、异龙脑（C）、混合标准溶液（D）、样品溶液（E）

3方法学建立

3.1 专属性 该方法专属性强。

3.2 线性范围 取左旋龙脑对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释成1 ml含1.036 mg的溶液作为标准储备液。精密量取标准储备液2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 ml分别置于5个10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，分别进样10 μL，以及进标样原液10 μL，15 μL，以左旋龙脑浓度c（mg/mL）为横坐标，对应峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为：Y=78694X+3011.5 ( R=0.9992，n=7)。结果表明左旋龙脑溶液在0.207~1.554 mg/mL范围内呈线性，峰面积与浓度线性关系良好。

3.3 重复性 分别称量样品10 mg，甲醇定容至10 mL，5份，上机测定，记录峰面积，计算样品中左旋龙脑含量。测得其含量的RSD=1.20%。结果见表1

表1 重复性试验（n=5）

称量（g）	0.0105	0.0101	0.0107	0.0105	0.0102
峰面积A	94444	90105	95888	91675	90120
含量（%）	96.61	95.82	96.25	93.78	94.90
含量均值（%）=95.47% RSD=1.14%

3.4 样品溶液稳定性考察 供试品溶液1份，分别在0-24 h进行测定，记录峰面积，计算得RSD=0.62%，表明左旋龙脑在24 h内稳定性良好。见表2

表2 样品溶液稳定性考察

时间（h）	0	2	4	8	10	12	24
峰面积（A）	92295	92876	93670	93973	93675	93096	92998
含量（%）	95.31	95.91	96.73	97.05	96.74	96.14	96.04
含量均值（%）=96.27% RSD=0.60%

3.5 加样回收率 精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3 mL各2份置试管，分别加入1 mL浓度为0.2 mg/mL样品溶液，上机测定，计算回收率，结果见表3

表3 加样回收率试验（n=6）

样品量 （mg）	测得量 （mg）	添加量 （mg）	加样回收率 （%）	平均加样回收率（%）	RSD (%)
0.21	0.32	0.10	102.59	101.01	1.02
0.21	0.31	0.10	99.56
0.21	0.41	0.20	100.71
0.21	0.41	0.20	101.41
0.21	0.52	0.31	101.27
0.21	0.52	0.31	100.50

3.6样品测定

分别精密量取左旋龙脑对照品和供试品溶液进样各10 μL，上机高效液相，按外标法以峰面积计算：供试品溶液主峰与对照品溶液主峰保留时间一致。

计算结果

A_X=92446;A_R=92598(n=5;RSD=1.20%)

称样量 （g）	峰面积A	含量 （%）	含量均值 （%）	RSD （%）
0.0105	94444	96.61	95.47	1.14
0.0101	90105	95.82
0.0107 ,	95888	96.25
0.0105	91675	93.78
0.0102	90120	94.90

3小结与讨论

3.1与现有技术相比，本实验建立了一种用于测定左旋龙脑含量的高效液相检测方法。该检测方法可准确测定左旋龙脑含量；本方法灵敏度高、专属性强，可有效检测左旋龙脑含量，为检测艾片中左旋龙脑含量提供可靠依据。

3.2本实验考察了流动相，其中甲醇或乙腈均可以作为有机相；同时初步对比了蒸干及冰箱冷冻析晶（重结晶法）样品含量，发现重结晶法得到的左旋龙脑含量较蒸干法得到的含量高；

3.3本实验方法对于右旋龙脑也进行了测定，发现在同样色谱条件下，右旋龙脑和左旋龙脑出峰时间是一样的，因此该方法不能检测出龙脑的旋光性，但可以借助旋光度测定仪加以区分^[9]。

参考文献：

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[3]王鸿发,元超,庞玉新.艾纳香中的黄酮类化合物及其抗菌活性[J].热带作物学报,2019,40(09):1810-1816.

[4]张颖,李翔,宋婷,许俊强,张应华,周恒苍.艾纳香挥发油的化学成分及抗细菌活性研究[J].北京农业,2015(17):224-226.

[5]王远辉. 艾纳香叶中左旋龙脑与精油的制备及其抗氧化与抗菌活性研究[D].江南大学,2013.

[6] 中国药典 2015 年版.一部[S]. 2015：131.

[7]张颖,李翔,宋婷,许俊强,张应华,周恒苍.艾纳香挥发油的化学成分及抗细菌活性研究[J].北京农业,2015(17):224-226.

[8]卫亚丽,汤洪敏,莫珊凤,严敏.不同产地黔艾纳香中左旋龙脑含量测定[J].中华中医药杂志,2015,30(01):278-280.

[9]王秋萍,何珺,马海霞,王黔阳,康冀川.HPLC-RID同时测定艾纳香叶中左旋樟脑、左旋龙脑及异龙脑含量[J].中华中医药杂志,2017,32(03):1267-1270.

[10]吴竹,杨佳年,王秋萍,何珺,陈伟,王黔阳,陈震,杨明武.HPLC-RID同时测定咽立爽口含滴丸中樟脑、石竹烯、龙脑、异龙脑含量[J].中华中医药杂志,2017,32(12):5625-5628.

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