高效液相色谱法测定土壤中丙烯酰胺的含量
翁咪娜1，王瑞1，王言伟1，孙晓韵1，陈云飞2*
（1杭州中一检测研究院有限公司，浙江 杭州 310052
2 浙江中一检测研究院股份有限公司 浙江 宁波 315000）
摘要 建立高效液相色谱法测定土壤中丙烯酰胺的含量，样品经超声提取、离心、过滤等步骤，经ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6×100mm，3.5μm）分离;甲醇-水（5：95，体积比）为流动相，DAD检测器波长210nm。方法在0.05～5.0μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数（r2）不小于0.999。土壤中丙烯酰胺的检出限为0.02mg/kg，加标回收率在77.1%～99.5%之间，测定结果的相对标准偏差均小于10%(n=6)。该方法适用于土壤中丙烯酰胺含量的检测。
关键词 高效液相色谱法；丙烯酰胺；土壤
Determination of acrylamide in soil by high performance liquid chromatography
Weng Mina1,Wang Rui1,Wang Yanwei1,Sun Xiaoyun1,Chen Yunfei2*
(1 Hangzhou Zhongyi Testing Institute Co., Ltd., Zhejiang Hangzhou 310052, China
2 ZheJiang ZhongYi Testing Institute Co.,Ltd, Zhejiang Ningbo 315000,China)
Abstract A method for determining acrylamide in soil by HPLC was established.The sample was separated by ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×100mm,3.5μm）after extracted by steps of ultrasonic,centrifugation,filtration,mobile phase was methanol and water (5:95,volume ratio) at 210nm of DAD.The linear ranges of acrylamide were 0.05～5.0μg/mL,the correlation coefficients were more than 0.999.The detection limits of acrylamide was 0.02mg/kg,the recoveries were between 77.1% and 99.5,and RSD were less than 10%(n=6).The method is suitable for the detection of acrylamid in soil.
Keywords HPLC; acrylamid; soil
丙烯酰胺是一种水溶性的小分子有机物，用于造纸、木材和纺织行业，其聚合物聚丙烯酰胺作为人工合成土壤改良剂广泛应用于国内外。聚丙烯酰胺本身无毒，但在土壤里会发生降解后产生有毒物质-丙烯酰胺[1]，国际癌症研究中心(IARC)将其列为人类可能2类致癌物(IIA)，在人体内代谢转化为具有致癌性的环氧丙酰胺[2-3]。土壤中的丙烯酰胺会直接或经由地下水通过皮肤、口腔等被人体吸收，从而引起神经中毒，运动失常[4]。目前，食品行业对丙烯酰胺的测定研究较多[5～7]，环境方面利用LC-MS、HPLC、GC测定水中丙烯酰胺的方法也较多[8～11]，但对土壤中丙烯酰胺含量的测定研究鲜有报道。虽然目前的研究并不能证明聚丙烯酰胺作为土壤改良剂对环境会产生负影响,但随着日益增加的施用量,以及土壤环境等因素的变化,究其是否产生公害,仍是值得关注和深入研究的问题[12]。
土壤样品经超声提取、离心、过滤等步骤后，采用高效液相色谱法测定丙烯酰胺的含量，该方法具有操作简单、灵敏度高、重现性好的特点，能够快速有效对土壤中丙烯酰胺的残留量进行测定。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
Agilent LC1260型液相色谱仪，二极管阵列DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6×100mm，3.5μm）,美国安捷伦科技有限公司；FPQ-1006HT型超声波清洗机，杭州法兰特超声波科技有限公司；TGL-20B型高速离心机，上海安亭科学仪器厂。
丙烯酰胺标准品：色谱纯，纯度为99.9%，北京坛墨质检有限公司；丙烯酰胺标准溶液（1000μg/mL）：准确称取丙烯酰胺标准品于50mL容量瓶中，用纯水溶解、稀释并定容；甲醇：色谱纯，纯度为99.9%；乙腈：色谱纯，纯度为99.9%；实验用水为超纯水。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
准确称取10.00 g土壤样品于50 mL带盖聚丙烯离心管中，用20 mL超纯水超声提取30min，8000r/min离心3min，取上清液经0.45μm水系针式滤器过滤后待测。
1.2.2 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6×100mm，3.5μm）；流动相甲醇：水(体积比为5：
95)，流速0.5mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量：5μL。
2 结果与讨论
2.1 仪器条件的确定
丙烯酰胺具有较强极性，在反相色谱柱上的保留相对较弱，可使用纯水作为流动相，但为了尽可能保护色谱柱，添加了一定比例的有机相。分别比较了以下几种流动相的比例：甲醇：水(10：90)；甲醇：水(5：95)；乙腈：水(5：90)；乙腈：水(10：90)，结果表明，在甲醇：水(5：95)条件下丙烯酰胺和样品中干扰物能达到较好的分离度；在0.3～0.6 mL/min范围内改变流动相的流速，发现当流速设置为0.5 mL/min时，峰形较好，具有较好的分离度。由图1可知，对丙烯酰胺的标准溶液用DAD光谱进行扫描，根据其在190～400nm波长范围内的扫描结果，丙烯酰胺的强吸收峰在190～200nm处，考虑到水和甲醇的截至波长分别为190nm和210nm，故选择210nm作为丙烯酰胺检测波长。图2为丙烯酰胺的标准液相色谱图。
图1丙烯酰胺190-400nm光谱扫描图
图2 1.0mg/L丙烯酰胺标准液相色谱图
2.2 提取条件的确定
由于丙烯酰胺是一种强极性、极易溶于水的化合物，故选择超纯水作为提取溶剂，通过超声提取，可以使土壤样品中的丙烯酰胺完全溶解到水中，然后高速离心，取上清液过滤，待测。
2.3 线性关系及检出限
取适量丙烯酰胺标准溶液，用超纯水稀释并定容，配制成100μg/mL丙烯酰胺标准使用液。分别取一定量的丙烯酰胺标准使用液至空白超纯水中，逐级稀释配制成质量浓度分别为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00μg/mL的系列标准工作溶液。按1.2.2仪器工作条件，按照由低到高的浓度依次进样检测，以保留时间定性，峰面积定量。丙烯酰胺的线性方程分别为y=62.8240606x＋0.5837162，相关系数(r2)=1.00000。
按照HJ 168-2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》 [13]确定检出限，分别在10g经处理后的石英砂（代替空白土壤样品）加, 入40μgL浓度为10μg/mL的丙烯酰胺标准溶液，再用20mL超纯水超声提取30min，离心取上清液待测，重复测定7次，计算测定值的标准偏差，以3倍标准偏差计算得土壤样品的检出限为0.02mg/kg。
2.4 加标回收试验
空白土壤样品分别加标后按标准方法步骤全程序测定6次，测定结果列于表1。
表1 加标回收试验结果
样品基质 | 组分 | 加标量/μg | 测定值/μg | 平均值/μg | 平均回收率/% | RSD% |
空白土壤 | 丙烯酰胺 | 1.20 | 1.13，1.13，1.03，1.15，1.03，1.09 | 1.09 | 91.1 | 4.8 |
丙烯酰胺 | 6.00 | 5.06，5.43，5.98，5.60，5.77，5.47 | 5.55 | 92.5 | 5.7 |
由表1可知，空白土壤样品中丙烯酰胺加标样品测定结果的相对标准偏差分别为4.8%、5.7%，平均加标回收率分别为91.1%、92.5%，空白加标结果符合分析测试质量控制要求。
采用经处理后的粉质粘土进行加标试验，按标准方法步骤全程序测定6次，测定结果列于表2。
表2 土壤样品加标回收试验结果
样品基质 | 组分 | 本底值/μg | 加标量/μg | 测定值/μg | 平均值/μg | 平均回收率/% | RSD% |
粉质粘土 | 丙烯酰胺 | 0.00 | 2.40 | 2.03，1.92，2.23，1.92，1.92，2.38 | 2.01 | 86.1 | 9.4 |
粉质粘土 | 丙烯酰胺 | 0.00 | 6.00 | 5.92，5.97，5.71，5.41，5.38，5.63 | 5.67 | 94.5 | 4.4 |
粉质粘土 | 丙烯酰胺 | 0.00 | 30.0 | 23.6，23.0，23.3，24.2，22.3，22.3 | 23.1 | 77.1 | 3.3 |
由表2可知，土壤样品基质加标后丙烯酰胺测定结果的相对标准偏差分别为9.4%、4.4%、3.3%，平均加标回收率为86.1%、94.5%、77.1%，说明该方法具有良好的精密度及准确度，结果符合分析测试质量控制要求。
图3为丙烯酰胺加标为2.40μg的土壤样品的色谱图。
图3加标为2.40μg的土壤样品色谱图。
3 结语
建立高效液相色谱法测定土壤中丙烯酰胺的含量，该法具有快速准确、前处理时间短、检出限低等优点，提取剂和流动相基本上都为超纯水，对环境污染少，准确度和精密度较好，可适用于土壤中丙烯酰胺的检测分析。
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