一种细胞靶向荧光成像探针的研制及其在快速高效细胞成像中的应用

　　

一种细胞靶向荧光成像探针的研制及其在快速高效细胞成像中的应用

张连晓，徐丹茵，孙鑫鑫，牛淑妍，钟华

（青岛科技大学 化学与分子工程学院，山东 青岛 266042）

摘要：本工作研制了一种细胞荧光成像探针，它可以快速高效的识别靶标细胞。探针由四种寡聚核苷酸片段所杂交形成，核心部分是一个十字型DNA结构，包含四个粘性末端、一个核酸适体端头，一个生物素端头。其中核酸适体赋予探针靶向功能，以便探针能够定位到目标细胞，生物素端头可连接荧光量子点，粘性末端使得十字型DNA自组装成为纳米级的探针颗粒。实验展示了该探针在加标血样中出色的染色效果，展现了良好的特异性和较强的荧光强度。该方法可用于复杂混合细胞样品的体外荧光成像检测。

关键词：DNA自组装；量子点；核酸适体；荧光成像

中图分类号：O652.1

Preparation of cell-targeted fluorescent imaging probe and its application in fast and efficient cell imaging

Zhang Lian-xiao, Xu Dan-yin, Sun Xin-xin, Niu Shu-yan, Zhong Hua

(College of Chemistry and Molecular Engineering, Qingdao University of Science & Technology, Qingdao 266042, China)

Abstract: In this work, we developed a fluorescent cell imaging probe, which can quickly and efficiently identify target cells. The probe is formed by hybridization of four oligonucleotide fragments. The core part of the probe is a cross-shaped DNA structure consisting of four sticky ends, an aptamer end, and a biotin end. Among them, nucleic acid aptamer gives the probe targeting function, so that the probe can locate the target cell, the biotin terminal can be connected with fluorescent quantum dots, and the sticky terminal makes the cross-shaped DNA self-assemble into nanoscale probe particles. The results show that the probe has excellent staining effect in blood samples with added standard, showing good specificity and strong fluorescence intensity. This method can be used for fluorescence imaging detection of complex mixed cell samples in vitro.

Key words: DNA self-assembly , Quantum Dot, DNA aptamer, fluorescence imaging.

基金项目：青岛科技大学科研启动经费

作者简介：张连晓（1994—），山东日照人，硕士在读，从事纳米复合材料的制备及生化分析方面的研究

荧光成像是生化、医学、临床诊断等研究领域的一种重要研究手段，该技术主要依赖于荧光成像探针，目前用于各种研究目的的商品化的荧光成像探针，种类丰富，功能强大，可以满足不同用户的常规性的检测需求。在细胞荧光成像研究领域，成像探针一般采用有机荧光染料作为信号标记物，其优点是易于化学修饰，制备简单，荧光强度能满足大多数研究的需要，缺点是有机荧光标记物容易发生荧光漂白，不能连续观测。因此，在一些需要长时间连续观测的研究场合，开发可供长时成像的特殊成像探针是十分必要的。

要避免荧光漂白，开发非有机分子荧光标记物是一种解决途径。在该领域，目前报道的非有机分子荧光标记物种类丰富，常见的有荧光量子点、荧光纳米簇等。例如碲化镉、硒化镉量子点^[1]就是一类较早应用的量子点荧光标记物，它们制备方法简单，荧光量子产率较高，且易于化学修饰，缺点是有一定的生物毒性，只适用于体外的成像研究，而不适用于体内荧光成像研究。为提高生物相容性，扩展其应用范围，研究者们进而又开发了诸如碳量子点、金纳米簇等荧光标记物，碳量子点^[2-3]具有很好的生物相容性，但荧光量子产率偏低，成像品质受到一定影响，金纳米簇等惰性重金属纳米簇，也具有相对较低的生物毒性，和不错的荧光量子产率，缺点就是稳定性较差，用它制备的成像探针往往需要现制现用，不易长久保存。

在细胞成像研究中，探针的特异性是研究者最为关心的问题，免疫学的发展为分子识别的特异性提供了保障，抗原-抗体的特异性识别作用往往被借鉴用于细胞荧光成像探针的设计，以使其能够识别特定细胞。然而并非所有类型的细胞都能找到适合其特异性检测的特定免疫分子。为解决这一问题，近年来发展出了一种新兴的技术，即SELEX（配体系统进化指数富集）技术^[4-5]，该技术的提出是基于一个重要的发现，即特定碱基序列的核酸分子片段（DNA或RNA）往往会在合适条件下形成一个特定的空间三维结构，且能够与某些分子（例如蛋白质分子）发生类似于抗原和抗体间的特异性结合作用。这一发现使得人们意识到，核酸分子也可以作为一类特殊的靶向分子而被应用。研究者们借助专门的设备，随机合成大量任意序列的核酸片段库，将需要研究的目标物质（例如某些蛋白分子，甚至是细胞本身）投入到这个巨大的核酸片段库中，以期发现并找到能与目标发生强结合作用的核酸片段，纯化并复制这些层层筛选出来的核酸片段，最终得到与目标物具有高度亲和力和特异性的核酸片段来，这些特殊的核酸片段被称为核酸适体（DNA aptamer）^[6]。与抗原-抗体特异结合体系类似，核酸适体体系也同样具备很强的特异结合能力，它们与其靶标的结合具有高度的专一性特征。非但如此，由于核酸分子的结构可设计性，其甚至拥有远高于抗原-抗体的运用灵活性，因此DNA适体技术是一种极具潜力的生物识别技术。

依照Watson-Crick碱基配对规则，DNA片段往往可以依照设计者的蓝图，通过碱基杂交自组装方式，形成特定的三维结构，这一技术被称为DNA折纸技术^[7-9]，它在生化探针的设计中十分有用，被用来实现各种意图，例如设计为某些巧妙的DNA结构从而赋予探针更多更强大的功能（例如运载药物、信号放大、循环检测、剪切及复制、事件开关、逻辑信号输出等）。

本工作借鉴以上技术，设计了一种细胞荧光成像纳米探针，该探针的核心构造是一种DNA十字型结构，包括：一段DNA适体、一段端头修饰了生物素（Biotin）的核酸片段、以及四个粘性末端。其中，DNA适体可针对Ramos细胞（B淋巴瘤细胞）发生特异性识别作用；端头修饰的生物素可连接荧光量子点，使得探针发光；四个粘性末端使得DNA十字结构通过自组装形成纳米颗粒探针，如原理图1所示（见结果与讨论）。

1 实验部分

1.1 主要的试剂和仪器

1.1.1 主要的试剂

实验所用试剂均为分析纯，氯化镉、硼氢化钠、碲粉、氢氧化钠、巯基乙氨、磷酸一氢钠、磷酸氢二钠（均购自国药化学试剂股份有限公司）；羟基琥珀硫亚氨、链霉亲和素、生物素、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐（购自Sigma-Aldrich公司）；IL-4FP试剂盒（重组白细胞介素荧光试剂盒，ACRO Biosystems）配制溶剂使用去离子二次蒸馏水。所用寡聚核苷酸（生工生物工程公司）DNA序列如下：

strand1:5’GGTACCCGGGCGGGCCGAGCACGCTCCGTGCG3’

strand2:5’AGGCCTCGCACGGAGCGAAAACGGCACGAGCGAACACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTGTTT 3’

strand3:5’CTGCAGCGCTCGTGCCGAAGGCGCGGCGAGCG3’

strand4:5’GCATGCCGCTCGCCGCGTTTACGGCCCGCCCGAAAAAA-(CH₂)₆-Biotin3’

1.1.2 主要的仪器

莱卡激光共聚焦显微镜（德国Leica SP5）；透射电子显微镜（日本JEM-2000EX/ASID2）。

1.2 生物素修饰的CdTe量子点制备

该实验属于体外培养的细胞作为标准，添加到血液样品中进行混合检测，因此无需太高的生物相容性，选择成本较低容易制备的碲化镉（CdTe QD）荧光量子点作为荧光标记物。合成方法如下：（1）碲氢化钠（NaHTe）前驱体的制备：准确称取60 mg硼氢化钠，以及90 mg碲粉转移到10毫升塑料管中，使用保鲜膜将管口扎死密封，氮气球绑粗针头扎入管口，另扎一根针头排气，向管中通入氮气排除管中空气。在氮气保护下用注射器向管中注入3毫升去离子二次蒸馏水。将管子置于避光处，室温（20摄氏度）反应5个小时，得到紫色的碲氢化钠（NaHTe）前驱体溶液，该溶液极不稳定，见空气马上氧化变质，只能采用带精密刻度的注射器吸取转移。（2）氯化镉反应液的配制：准确移取浓度为3 mmol/L的CdCl₂水溶液80 mL到三口烧瓶中，并放入磁力搅拌子。准确称取50 mg 巯基乙氨加入该烧瓶，匀速搅拌下滴加0.2 mol/L的NaOH水溶液调节pH值到9.0，通入氮气排除溶液中的溶解氧。在氮气流保护下，用带刻度的注射器移取（1）中所制备的碲氢化钠（NaHTe）前驱体溶液500 μL，迅速注入（2）中三口烧瓶中，三口烧瓶中间口接回流冷凝管，冷凝管上口用保鲜膜扎住，用针扎两小眼排气，三口烧瓶另一口接氮气瓶，保证反应过程中一直有氮气保护。加热至沸腾，回流反应5小时左右，瓶中溶液由浅棕黄色变为亮橙色时反应结束。停止加热自然冷却降温，倒出装在100 mL样品管中。（3）分别将500 μL浓度为50 mmol/L的羟基琥珀硫亚氨，以及500 μL浓度为50 mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐，加入到100 mL上一步的样品管中，置于30摄氏度恒温摇床中活化1小时，取出并向管中加入500 μL浓度为50 mmol/L的生物素（Biotin），置于30摄氏度恒温摇床中反应24小时，取出放到冰箱冷藏中4摄氏度避光保存，该产物溶液记为“CdTe-Biotin”溶液。

1.3 荧光纳米探针的制备

取一只5 mL容积的塑料样品管，向其中分别加入四种DNA水溶液（strand1，strand2，strand3，strand4），体积均为200 μL ，浓度均为50 μmol/L，得到800 μL四种DNA的混合液。随即向管中加入200 μL浓度为50 mmol/L的链霉亲和素水溶液，室温20摄氏度下反应1个小时后，再向管中加入1 mL之前制备好的“CdTe-Biotin”溶液，室温 20摄氏度反应3个小时，随之缓慢降温（1小时内从20摄氏度逐渐降温到4摄氏度）。之后采用高速离心分离（1万转每分钟离心分离20分钟）获得探针浓缩物，抽去上层清液，加入pH 6.80的PBS缓冲溶液定容到1 mL，超声波震动分散后放于冰箱冷藏4摄氏度避光保存，该产物记为最终探针产品：“CdTe-Biotin-DNA探针”。

1.4 细胞的荧光成像

人源Burkitt淋巴瘤细胞CRL-1596 （Ramos）细胞，采用标准培养办法培养。于RPMI 1640培养基中加入10％的胎牛血清和100 IU/mL的青霉素-链霉素，培育室气氛条件为95%的空气混合5 % 的CO₂，培养瓶置于培养箱中36.5 °C繁殖。

取CRL-1596细胞样本少量滴涂在细胞计数板下观测，密度达到每毫升10万个以上则满足检测条件取出待用。取500 μL CRL-1596细胞样本于1.5毫升容积样品管中，浓度约为10万个每毫升。另取500 μL人血液稀释样品（用pH 6.8 的PBS缓冲溶液稀释10倍的人血样品）加入到以上CRL-1596细胞样本管子中，得到1 mL混合细胞样品。

向混合细胞样品中加入200 μL“CdTe-Biotin-DNA探针”，轻柔的摇动使其混合均匀，并置于4摄氏度的低温下反应40分钟。取出后取适量制成显微镜样片于莱卡激光共聚焦显微镜下观察并拍摄成像结果。

2 结果与讨论

2.1 荧光纳米探针的结构

本工作制备的荧光纳米探针为DNA与荧光量子点的自组装纳米颗粒，命名为“CdTe-Biotin-DNA探针”。其可能的结构如图1所示。核心结构为一个由四种DNA杂交而成的十字型结构，每一条DNA的5’端前5个碱基均为粘性末端，是没有杂交的裸露单链部分，其碱基序列具有回文特征，可与自身反向杂交，又都由于每条链的这部分只含5个碱基，不能形成牢固的杂交，故此称为粘性末端。在较低温度下（4摄氏度），十字型DNA结构由其上的四个粘性末端介导发生自组装反应，形成图1所示的DNA方格网络结构，最终使得探针形成较大的DNA自组装纳米颗粒。

其中DNA strand2的3’端含有碱基数为52个的一段裸露单链，这部分裸露的52个碱基是Ramos细胞（CRL-1596细胞）的DNA适体（DNA aptamer），能够与Ramos细胞发生高度专一的特异性识别反应，因此可以介导探针结合到Ramos细胞表面。

DNA strand4的3’端修饰有生物素（Biotin）因此可以与链霉亲和素发生结合反应，将链霉亲和素锚定在DNA方格网络上，链霉亲和素与生物素的结合比是4：1，即一个链霉亲和素可以与4个生物素相结合。因此锚定在DNA方格网络上的链霉亲和素，理论上还空余3个未参与结合的位点，在制备荧光探针的过程中，最后一步是加“CdTe-Biotin”，所以每个链霉亲和素剩下的三个空闲位点均可以再结合一个CdTe-Biotin。最终形成如图1所示的荧光探针结构。从图中可以看出，该荧光探针是一种DNA自组装探针，必然会形成聚集态颗粒，探针携带大

图1 CdTe-Biotin-DNA荧光探针的组装示意图

Fig.1 Configuration of the CdTe-Biotin-DNA probe

对合成出的CdTe量子点的荧光性能进行表征。通过3D荧光成像谱图可知，CdTe量子点在较长的激发光范围内具有稳定的荧光信号，具有较长的斯托克斯位移。同时最大激发波长在350 nm附近，选用此波长作为激发光，得到图2（B）的荧光曲线，最大发射波长在600 nm左右，为橙色荧光。



图2 （A）CdTe量子点的3D荧光表征（B）CdTe 量子点的荧光曲线（Ex=350 nm）

Fig.2 3D fluorescence characterization of CdTe quantum dots (B) Fluorescence curve of CdTe quantum dots (Ex=350 nm)

2.2 探针运用于细胞的荧光成像

按照实验1.4步骤处理混合细胞样品，向混合细胞样品中加入200 μL“CdTe-Biotin-DNA探针”，轻柔的摇动使其混合均匀，并置于4摄氏度的低温下反应40分钟。取出后取适量制成显微镜样片于莱卡激光共聚焦显微镜下观察并拍摄成像结果，如图2所示。

图3 探针用于混合样品的荧光成像

Fig.3 Mixed cell imaging by used probe

稀释血液样品中含有红细胞、白细胞（嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等）血小板，以及血清中的大量其它有机分子，并且混合了体外培养的Ramos细胞（B淋巴瘤细胞，CRL-1596），为的是提供一个较为复杂的检测环境，以便观察探针的特异性是否良好。

激光共聚焦显微照片A1，A2为暗场荧光像，B1，B2为透射通道的明场像且分别对应A1和A2区域。在A1，A2中均可观测到被染成红色的球状细胞， B1，B2对应位置清晰可见细胞的轮廓。

图4 和商品探针同时染色，定位区域完全一致

Fig.4 Stained at the same time as the commercial probe, the location area was exactly the same

为证明“CdTe-Biotin-DNA探针”确实只是对靶标细胞Ramos进行了特异性的染色，采购了商品化的细胞荧光探针IL-4FP（绿色荧光素FAM标记的IL-4重组白细胞介素），这种探针可针对Ramos细胞进行成像。使用自制探针和商品探针同时对混合细胞进行染色，如果两者都对Ramos细胞具有特异性，则它们的荧光像应该是高度重合的，从而可以证明探针具备特异性。实际成像结果如图3所示，可以清晰的看到商品探针，图3中绿色像照片，和自制探针，图3中红色像照片，以及两者的叠加影像，图3中黄色像照片。显示了色彩区域的高度的一致性（红色和绿色叠加由于混色原理，表现为黄色），证明本工作自制的探针具备和商品探针一样的特异性，确实是针对Ramos细胞具有较强的识别能力。

3 结论

本工作提出的“CdTe-Biotin-DNA探针”是一种自组装纳米荧光探针，该探针拥有独特的DNA自组装结构，其设计允许方便的将各功能部件通过“组合”的形式一一拼装起来，探针合成步骤简单，反应条件温和。能够在较为复杂的模拟环境中进行高特异性的细胞成像检测。在混合血液样品中表现出了出色的识别及成像品质，探针采用了双重信号放大策略，即利用链霉亲和素与生物素的4：1结合比例，以及DNA网络方格化的自组装结构，提高了荧光标记物（CdTe量子点）在探针中的携带量，使得荧光强度得到显著增强。另一方面，自组装探针的网络方格结构提升了探针整体紧凑性，使得其上携带的DNA适体多而且相对集中，增加了分子反应的碰撞几率，提高了探针与靶标间的结合效率。

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