化妆品含有多种营养成分，适宜微生物生长繁殖。细菌、霉菌等微生物含量的超标是国家监督抽查化妆品常出现的质量问题。化妆品微生物是影响化妆品卫生安全的重要指标，其中霉菌是化妆品微生物检验中的一项重要指标。霉菌总数是指化妆品检样在一定条件下培养后，1g或1mL化妆品中所污染的活的霉菌的总数，是判明化妆品是否被霉菌污染的重要指标[1]。化妆品的霉菌污染不仅会影响产品本身的质量，更严重的会影响使用者的健康，例如导致皮肤癣症等。自从我国颁布了化妆品卫生标准以及出台了化妆品卫生监督管理条例，加强了卫生监督和检测，我国化妆品微生物污染率明显下降，但污染情况仍时有发生。2019年-2021年本实验室日常检验化妆品共4607份，检出霉菌污染超标22份，超标率为0.478%。因此，对化妆品中霉菌总数进行测量不确定度的评定，是实验室内部质量控制的一部分，对提供准确的数据具有重要意义。
1材料与方法
1.1材料和试剂 黑曲霉CMCC98003购于环凯生物有限公司、虎红琼脂培养基（批号J1578Y）购于环凯生物有限公司
1.2实验方法 化妆品加标处理：每个测试样品加入适当数量的黑曲霉菌，并充分混匀样品。
化妆品检验：在实验室由3名检测人员按照《化妆品安全技术规范》（2015年版）第五部分微生物检验方法[2]，同时进行一段时间测试，检验化妆品中的霉菌总数指标。检测人员在局部百级的洁净室进行操作，分别从两个包装完整的样品中共取样10g，并用生理盐水进行10倍的倍比稀释，分别得到 1：10、1：100、1:1000的检液。每个稀释度分别吸取1mL检液至灭菌平皿中，加入虎红培养基并充分摇匀，置28℃±2℃培养5天，每个样品均做平行样，同时做空白对照。计算结果时，选取菌落数在5-50个范围内的平皿进行霉菌总数的计数。
2结果与分析
2.1不确定度来源的确定与分析 化妆品检测步骤主要包括样品称量、稀释、均质、加样、混匀、培养、平皿计数和结果修约等[3]。整个试验由3名检测人员对相同的7份样品同一时间进行平行检测，由于微生物检验的结果分散性较大，影响因素非常多，检测过程引入的不确定度主要有样品的称量、样本稀释、培养条件和不同检测人员的重复性检测，其中后续培养过程条件相对固定，其引入的不确定度可忽略不计。
2.2测量不确定度的评定方法 不确定度的评定一般分为测量不确定度的A类评定（随机效应引起的）和测量不确定度的B类评定（系统影响引起的），均用标准偏差表征。本实验是对不同7份样品同一时间由实验室3名技术人员进行平行检验的霉菌总数的检验数据，在重复性和重现性试验的基础上进行不确定度的A类评定更为客观，并具有统计学的严格性。除此之外，还需要考虑称量及加样时使用的仪器和容器的示值误差所引入的不确定度分量进行不确定度的B类评定。
2.3不确定度计算
2.3.1 不同检测人员重复检测引入的不确定度 本实验是同一时间由实验室3名技术人员对不同7份样品进行7次平行检验，每次检验有2个平行数据。其中，根据《化妆品安全技术规范》中所规定的霉菌总数的测定方法，得到霉菌总数的测试结果见表1。使用指数法将检验结果取对数，利用贝赛尔公式计算合并样本标准偏差，计算检验结果的测量不确定度。
表1 实验霉菌总数计算结果
|
序号 |
测量结果 |
取对数后 |
均值 |
残差平方和 |
||
|
X1 |
X2 |
log X1 |
log X2 |
|
||
|
1 |
150 |
140 |
2.176 |
2.146 |
2.161 |
0.000450 |
|
2 |
120 |
140 |
2.079 |
2.146 |
2.113 |
0.002245 |
|
3 |
150 |
150 |
2.176 |
2.176 |
2.176 |
0.000000 |
|
4 |
110 |
130 |
2.041 |
2.114 |
2.078 |
0.002665 |
|
5 |
140 |
130 |
2.146 |
2.114 |
2.130 |
0.000512 |
|
6 |
190 |
180 |
2.279 |
2.255 |
2.267 |
0.000288 |
|
7 |
130 |
120 |
2.114 |
2.079 |
2.097 |
0.000613 |
|
8 |
150 |
150 |
2.176 |
2.176 |
2.176 |
0.000000 |
|
9 |
140 |
170 |
2.146 |
2.230 |
2.188 |
0.003528 |
|
10 |
110 |
120 |
2.041 |
2.079 |
2.060 |
0.000722 |
|
, 11 |
120 |
130 |
2.079 |
2.114 |
2.097 |
0.000613 |
|
12 |
130 |
130 |
2.114 |
2.114 |
2.114 |
0.000000 |
|
13 |
140 |
120 |
2.146 |
2.079 |
2.113 |
0.002245 |
|
14 |
100 |
120 |
2.000 |
2.079 |
2.040 |
0.003121 |
|
15 |
190 |
190 |
2.279 |
2.279 |
2.279 |
0.000000 |
|
16 |
120 |
120 |
2.079 |
2.079 |
2.079 |
0.000000 |
|
17 |
110 |
110 |
2.041 |
2.041 |
2.041 |
0.000000 |
|
18 |
160 |
150 |
2.204 |
2.176 |
2.190 |
0.000392 |
|
19 |
120 |
130 |
2.079 |
2.114 |
2.097 |
0.000613 |
|
20 21 |
120 130 |
120 130 |
2.079 2.114 |
2.079 2.114 |
2.079 2.114 |
0.000000 0.000000 |
|
∑ |
|
|
|
|
|
0.018007 |
对检验结果X1 和X2取对数，分别得到lgX1，lgX2以及两者的平均值
Sj=
Sj2=
Sp=
标准不确定度为：Us=
2.3.2 样本称量引入的不确定度
检测过程中，技术人员在万级环境下使用精确度为0.01g的电子天平称取10.00g样品，应考虑由天平本身引入的不确定度分量。根据JJG1036-2008《电子天平检定规程》[4]的规定，准确度级别为III级的电子天平在称量范围为0-500g时最大允许误差为±0.5e，假定为均匀分布，置信因子
2.3.3样本稀释引入的不确定度
稀释过程中，技术人员使用10000μL移液管吸取生理盐水进行稀释，制成1：10稀释液。根据JJG646-2006《中华人民共和国国家计量鉴定规程移液器》[5]规定：在标准温度时，10000μL移液器吸取容量10000μL时允许最大误差为±0.6%，假定为三角形分布，置信因子
2.3.4 合成不确定度
2.3.5扩展不确定度 重复测量2次，置信概率为95%，自由度v=20，查t分布表得包含因子k95(20)=2.086，因此本实验在包含概率为95%时的扩展不确定度Up为：
Up=kUc=2.086×0.03666=0.0765≈0.077
因此，两次检测结果的对数值取平均值时，其取值区间分布于±0.077之间，每一次测量均可采用这一取值区间计算不确定度。
2.3.5不确定度报告
不确定度的计算为lgx=
3.讨论
测量不确定度是对测量结果可信性、有效性的质疑或不能肯定的程度，是说明测量结果质量的一个参数。因此正确的不确定度的评定对客观分析测量结果有重要的意义。目前，ISO/IEC17025是国际上统一的对检测和校准实验室能力的通用要求[6]，其在内容和技术方面强化了对测量不确定度的评定，表明在适当时候要对测量结果的不确定度进行评定。微生物检验影响因素多，不同技术人员操作手法差异大，对检验结果有一定的影响，结果重现性较差，因此在微生物检验中应引入测量不确定度的评定，检验结果更加科学可靠。
化妆品中含有丰富的营养成分，包括脂肪、蛋白质、氨基酸、无机盐等，一些美白祛斑类化妆品还含有维生素、熊果酸、胎盘液等功能性营养成分，适合微生物的生长[7]。因此，微生物指标超标造成产品不合格是国家监督抽查发现化妆品常出现的质量问题。但化妆品使用的防腐剂与食品中使用的相比，用量更大，抑菌作用更强，因此化妆品中微生物繁殖不如食品中严重，部分检测人员对化妆品的微生物检验不重视，检验过程随意，不严格按规范操作，从而造成结果偏差。众所周知，样品重复测定引入的不确定度主要是由不同人员操作以及操作重复性产生，因此本次试验是由实验室3名技术人员同一时间对不同7份样品进行7次平行检验，通过计算不同人员操作及重复试验产生的不确定度，提高检测结果的可靠性和科学性。本次试验结果相差较大，直接用贝塞尔公式计算标准偏差不合适，故采取将结果取对数后，用合并样本标准差的方法求检验结果的不确定度[8-10]。这样的方法更科学有效，且适用于每个样本，不断增加的检验结果，可以加入到合并样本中，重新计算合并样本标准差，可更新其不确定度的取值范围，不确定度越小，测量结果质量越高，反之亦然。由本次实验结果可见，当样本中霉菌总数检测结果以平行样对数值的平均值表示时，检验结果取值区间分布于X±0.077之间，而获得此次化妆品霉菌检验的不确定度，增加了测量结果之间的可比性。此外，霉菌检验结果散发性较大，检验过程必须严格按照标准规范操作，使用合格的计量器具，保证检验数据的准确性和可靠性。
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