气相色谱法测定1-叔丁氧羰基哌嗪中哌嗪的方法学研究

　　

气相色谱法测定1-叔丁氧羰基哌嗪中哌嗪的方法学研究

伍鸣亮[*]，张运海，曾海金，罗恒真

（江西青峰药业有限公司，江西 赣州 341000）

摘要：建立气相色谱法测定1-叔丁氧羰基哌嗪中的哌嗪，该方法使用非极性固定相的气相色谱柱（Agilent CP-Volamine 30 m × 0.32 mm）。起始温度为80 ℃，保持2分钟，以每分钟20 ℃的速率升温至200 ℃并保持6分钟；检测器温度为300 ℃；进样口温度为180 ℃；载气流速为每分钟4.0 ml。进样体积1 μl。哌嗪的定量限为3.2 μg/mL，在3.2 μg/mL至80 μg/mL之间的线性函数关系较好，平均回收率为100.94%，回收率RSD为1.3%。本方法的专属性和检测准确度均较好，检测灵敏度较高，可用于1-叔丁氧羰基哌嗪的质量控制。

关键词：气相相色谱法；1-叔丁氧羰基哌嗪；哌嗪；方法学

中图分类号：O656.3　文献标识码：A　文章编号：

GC Analysis and Methodology Research for piperazine in 1-(tert-butoxycarbonyl) piperazine

Wu Mingliang , Zhang Yunhai , Zeng Haijin , Luo Hengzhen

(Jiangxi Qingfeng Pharmaceutical Co., Ltd., Ganzhou 341000)

Abstract: A GC method has been established for detecting the piperazine in 1-(tert-butoxycarbonyl) piperazine， A non-polar stationary phase gas chromatography column (Agilent CP-Volamine 30 m × 0.32 mm) was used. Maintain the column temperature at 80 ℃ for 2 minutes ,than raise temperature at a rate of 20 ℃ per minutes to 200℃ and maintain for 6 minutes; the temperature of detector is 300 ℃; the temperature of injetion port is180℃; the flow rate of the carrier gas is 4.0 ml per minute. The injection volume is 1 μl. The limit of piperazine was 3.2 μg/mL, the method was linear from 3.2 μg /mL to 80 μg/mL, the accuracy was similar with a mean (RSD) ratio of 100.94% (1.3%). The method is specific,accuracy and sensitive, and can be used for the quality control of 1-(tert-butoxycarbonyl) piperazine.

Keywords: GC;1-(tert-butoxycarbonyl) piperazine;piperazine;Analytical Validation

1-叔丁氧羰基哌嗪是一种哌嗪类单取代化合物,是一种重要的医药化工起始物料或中间体,可用于合成许多具有生物活性的物质，如：① 4-(3-{[4-(环丙基羰基)哌嗪-1-基]羰基}4-氟苯基)甲基]酞嗪-1(2H)-酮，是一种创新的口服多聚腺苷二磷酸酯核糖聚合酶（PARP）强抑制剂，有着低毒并不易使细胞产生耐药性的特点。多用于乳腺癌基因（BRCA）突变的晚期卵巢癌的治疗，并有报道指出，该化合物对多种乳腺癌也同样有着显著的疗效，并且与其他抗肿瘤药物一起联合使用时，可以显著地减小肿瘤细胞的耐药性，在临床上有着非常重要的作用和意义^[1-2]；②哌嗪甲酰胺类，该类物质里同样含有多种能够在人体内有着较好的生物活性的物质，比如N-噻二唑基哌嗪，能够快速有效地抑制住脂肪酰胺水解酶的活性^[3]。

当前，1-叔丁氧羰基哌嗪的相关文献研究大多集中在其合成工艺方面，但对其质量控制方面的文献相对较少。根据1-叔丁氧羰基哌嗪工艺合成路线（见图1），哌嗪作为1-叔丁氧羰基哌嗪合成过程中的关键原料^[4]，其残留在1-叔丁氧羰基哌嗪中的可能性较大，因此建立一个良好的哌嗪测定分析方法对1-叔丁氧羰基哌嗪的质量控制有着重要的意义，本文采用气相色谱法定量测定1-叔丁氧羰基哌嗪中哌嗪的含量。

图1 1-叔丁氧羰基哌嗪合成路线图

Fig.1 The synthesis of 1-(tert-butoxycarbonyl) piperazine

1 仪器与试剂

1.1仪器

气相色谱仪配备氢火焰离子化检测器（Agilent 7890B ）；分析天平（Mettler Toledo XS105DU）；。

1.2试剂

1-叔丁氧羰基哌嗪供试品（来源：自制）；1-叔丁氧羰基哌嗪对照品（来源：苏州昊帆生物股份有限公司；含量：100.0%）；哌嗪对照品（来源：Macklin Biochemical Co., Ltd；含量：100.0%），乙醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Agilent CP-Volamine 30 m × 0.32 mm。起始温度为80 ℃，保持2分钟，以每分钟20 ℃的速率升温至200 ℃并保持6分钟；检测器为氢火焰离子化检测器（FID），检测器的温度设定为300 ℃；进样口温度设定为180 ℃；分流比为3:1；载气为氮气，流速设置为每分钟4.0 ml。进样体积1 μl。

2.2溶液的配制

空白溶液：乙醇。

对照品溶液的配制：称取哌嗪对照品适量，加乙醇溶解并稀释制成每1 mL中约含哌嗪0.04 mg的溶液，即得。

供试品溶液的配制：称取1-叔丁氧羰基哌嗪供试品适量，加乙醇溶解并稀释制成每1 mL约含1-叔丁氧羰基哌嗪40 mg的溶液，即得。

2.3专属性及系统适用性

取上述“2.2溶液的配制”项下各溶液，依法进样测定，其中对照品溶液连续进样6针，计算主峰峰面积和保留时间的相对标准偏差（RSD）以考察系统精密度，结果见表1。

表1哌嗪专属性及系统适用性考察结果

Table 1 Specificity and system suitability test

序号	保留时间（min）	峰面积	理论板数	拖尾因子
1	81.285	6.011	90265	1.05
2	82.054	6.010	90157	1.05
3	81.663	6.010	90103	1.06
4	81.970	6.010	90228	1.05
5	81.821	6.011	90129	1.06
6	81.371	6.010	90309	1.05
平均值	81.285	6.011	/	/
RSD	0.4%	0.1%	/	/

结果表明：空白溶液不影响哌嗪的检测，供试品溶液中1-叔丁氧羰基哌嗪峰与杂质峰均不影响哌嗪的测定；对照品溶液中哌嗪峰理论板数（N）最小为90103，拖尾因子（T）最大为1.06；供试品溶液中哌嗪峰与相邻峰之间的分离度（R）为13.5，大于1.5。

2.4检测限与定量限

取哌嗪对照品适量，精密称定，用乙醇逐级进行稀释，依法测定，按哌嗪峰信噪比（S/N）不低于3作为检测限，信噪比（S/N）不低于10作为定量限。并取定量限考察溶液连续进样6次，以考察哌嗪在该浓度下是否符合定量要求的精密度，考察结果见表2～表3。

表2哌嗪检测限考察结果

Table 2 LOD investigation of piperazine

名称	浓度（μg/ml）	相对供试品浓度（ppm）	保留时间（min）	峰面积	S/N
哌嗪	0.96	24	6.010	2.004	4.5

表3哌嗪定量限考察结果

Table 3 LOQ investigation of piperazine

实验结论：该检测方法下，哌嗪定量限浓度为3.2 μg/ml，相对供试品浓度为80 ppm，连续进样6针定量限考察溶液哌嗪峰面积相对标准偏差（RSD）小于10%，S/N均大于10；哌嗪检测限浓度为0.96 μg/ml，S/N大于3。符合规定。

2.5溶液稳定性

取对照品溶液、供试品溶液室温放置，分别于0、5、10、15、20和25小时取样测定，计算各时间点哌嗪峰面积相对0小时的变化率绝对值，考察见表4。

表4溶液稳定性考察结果

Table 4 Solution stability

序号		浓度（μg/ml）	相对供试品浓度（ppm）	保留时间（min）	峰面积	S/N
1		3.2	80	6.010	5.995	14.2
2				6.011	6.016	14.2
3				6.010	5.847	13.8
4				6.011	5.720	13.1
5				6.011	6.143	14.5
6				6.010	6.233	14.1
平均值		/	/	6.011	5.992	14.0
RSD	/		/	0.1%	3.2%	/

时间（小时）	对照品溶液	供试品溶液
0	81.204	7.311
5	81.007	7.240
10	81.709	7.136
15	81.975	7.462
20	82.654	7.429
25	83.117	7.458
RSD	1.1%	1.9%

对照品溶液中哌嗪峰面积的RSD为1.1%，供试品溶液中哌嗪峰面积的RSD为1.9%，均小于2%，符合验证要求，可认为对照品溶液、供试品溶液室温放置25小时内稳定。

2.6线性

取哌嗪对照品适量，精密称定，在相当于供试品溶液浓度0.008%（3.2 μg/mL）至0.2%（80 μg/mL）的浓度范围内，制备8份不同浓度的哌嗪对照品溶液，依法测定，使用最小平方法用峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，求得哌嗪的线性方程为：y = 1.9769 x + 1.1959，线性相关系数r为0.9995。结果表明，哌嗪在3.2 μg/mL至80 μg/mL的浓度之间的线性函数关系较好。见图2。

图2 哌嗪标准曲线图

Fig.2 Standard Curves of piperazine

2.7准确度

称取1-叔丁氧羰基哌嗪对照品和哌嗪对照品各适量，用乙醇溶解并制成每1 mL含1-叔丁氧羰基哌嗪约40 mg和哌嗪约40 μg的混合溶液，作为准确度考察溶液，平行配制6份上述溶液。取对照品溶液和准确度考察溶液依法进行测定，计算哌嗪的回收率及RSD，结果见表5。

表5哌嗪回收率考察结果

Table 5 Recovery rate of piperazine

序号	峰面积	供试品浓度 （mg/ml）	本底量（μg/ml）	加入量 （μg/ml）	实际测得量（μg/ml）	回收率（%）	平均值（%）	RSD（%）
1	89.535	40.29	3.63	40.05	43.78	100.27	100.94	1.3
2	88.783	40.46	3.64	40.05	43.41	99.31
3	90.625	40.53	3.65	40.05	44.32	101.54
4	89.968	40.23	3.62	40.05	43.99	100.81
5	91.812	40.11	3.61	40.05	44.90	103.09
6	89.865	40.44	3.64	40.05	43.94	100.64

结果6份准确度考察溶液的回收率均在90%～108%之间，平均回收率为100.94%，回收率RSD为1.3%，小于3%，符合验证要求，本方法准确度良好。

2.8精密度

取1-叔丁氧羰基哌嗪供试品，根据所述的方法，平行配制6份供试品溶液，取对照品溶液和供试品溶液依法进行测定，计算各供试品溶液中哌嗪含量及RSD，结果见表6。

表6哌嗪重复性考察结果

Table 6 Repeatability of piperazine

序号	峰面积	供试品浓度（μg/ml）	哌嗪含量（%）	平均值（%）	RSD（%）
1	7.566	40.05	0.0092	0.009	2.6
2	7.459	40.23	0.0091
3	7.696	40.35	0.0093
4	7.983	40.16	0.0097
5	7.567	40.41	0.0092
6	7.531	40.27	0.0091

结果：6份供试品溶液中哌嗪平均含量为0.009%，RSD为2.6%，小于5%，符合验证要求，本方法重复性良好。

2.9耐用性

称取1-叔丁氧羰基哌嗪对照品和哌嗪对照品各适量，用乙醇溶解并制成每1 mL含1-叔丁氧羰基哌嗪约40 mg和哌嗪约40 μg的混合溶液，作为耐用性考察溶液，进样对照品溶液、供试品溶液、耐用性考察溶液，在拟定色谱条件的基础上，微小改变流速、色谱柱初始温度、进样口温度、不同批次色谱柱等相关参数后考察方法耐用性，计算各耐用性条件下测得浓度的回收率相对正常条件下回收率的相对偏差（|RD|），结果见表7。

表7耐用性考察结果

Table 7 Robustness test

耐用性条件		回收率（%）	与正常条件比较|RD|
正常条件（准确度平均回收率）		100.94	/
流速-1（3.8 ml/min）		99.41	0.8%
流速-2（3.8 ml/min）		100.07	0.4%
进样口温度-1（175 ℃）		98.98	1.0%
进样口温度-1（185 ℃）		98.12	1.5%
色谱柱初始温度-1（78 ℃）		99.12	1.0%
色谱柱初始温度-2（82 ℃）		99.56	0.7%
不同批号色谱柱		98.69	1.2%

结果表明，各耐用性考察条件下哌嗪回收率均在98.12% ～ 100.17%，与正常条件下回收率比较相对偏差均小于2%，符合验证要求。因此该检测方法在使用不同批次色谱柱、流速3.8 ml/min ～ 4.2 ml/min、进样口温度175 ℃ ～ 185 ℃及色谱柱初始温度78 ℃ ～ 82 ℃范围内，耐用性良好。

3 讨论

实验结果表明，本方法在专属性及系统适用性、检测限与定量限、线性、精密度、准确度及耐用性验证测试中均具有良好特性。可作为1-叔丁氧羰基哌嗪中哌嗪含量测定的方法。

参考文献：

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[2] 来芳芳，李 杰，季 鸣，等. 奥拉帕尼对Taxol抗乳腺癌4T1的增敏作用[J]．药学学报，2016，5 1(6)：907-912.

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[4] 金德龙，张雪梅，刘焕，等. N-叔丁氧羰基哌嗪的合成新工艺[J]．山东化工，2017，46(16)：38 -39．

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作者简介：伍鸣亮（1993-），男（汉族），江西赣州人，本科，初级工程师，主要从事药物质量研究工作。

地址：江西省赣州市章贡区沙河工业园站东大道8号江西青峰药业有限公司，

E-mail: wumingliang1002@163.com

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