HPLC法测定雷美替胺与其对映异构体的含量

　　

HPLC法测定雷美替胺与其对映异构体的含量

张新勇 葛雪松 卓静 孙桐 （江苏省宿迁市食品药品检验所 223800）

摘要 目的：建立雷美替胺相关制剂中雷美替胺与其对映异构体的液相分析测定方法。方法：采用手性柱DAICEL AD-H(4.6mm×250mm, 5μm)为色谱柱，以正己烷-乙醇-甲磺酸（900:100:0.1)为流动相，柱温为25℃，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，进样量为10μl。结果：雷美替胺与雷美替胺对映异构体分别在0.20μg/ml～20.20μg/ml、0.20μg/ml～19.67μg/ml浓度范围内，雷美替胺与雷美替胺对映异构体标准曲线的线性关系均良好（r>0.999），定量限均为2ng/ml，平均回收率分别为99.00%，99.02%，RSD分别为1.01%与0.33%（n=9）。结论：该方法专属性较强，灵敏度高，稳定性好，可以为雷美替胺相关制剂中雷美替胺与其对映异构体的质量控制与有关物质研究提供参考。

关键词: 雷美替胺；雷美替胺对映异构体；雷美替胺相关制剂；质量控制

Determination of Ramelteon and Its Enantiomers by HPLC

Zhang Xin-yong, Ge Xue-song, Zhuo Jing, Sun Tong

(Suqian Institutes for Drug and Food Control,JiangSu SuQian 223800,China)

Abstract Objective: To establish a method for the determination of ramelteon and its enantiomers in rametidine related preparations by liquid chromatography. Method: An DAICEL AD-H(4.6mm×250mm,5μm)was used, the mobile phase consisted of n-hexane-ethanol- methanesulfonic acid (900:100:0.1), the column temperature was 25℃,the flow rate was 1.0ml/min, the detection wavelength was 220nm ,the sample volume was 10μl. Results: The linear relationship was good (r>0.999) in the range of 0.20μg/ml~20.20μg/ml and 0.20μg/ml~19.67μg/ml for ramelteon and its enantiomer, respectively.The limit of quantitation of 2ng/ml.The average recovery was 99.00% and 99.02%, respectively. The RSD was 1.01% and 0.33%, respectively (n=9). Conclusion: This method has strong specificity, high sensitivity and good stability, which can provide reference for the quality control and related substances research of ramelteon and its enantiomer in ramelteon related preparations.

KEY WORDS: Ramelteon ; Ramelteon Enantiomers ; Remetidine-related preparations ；Quality Control

雷美替胺(Ramelteon)，是一种褪黑激素受体激动剂，在体内能够模拟由松果体分泌的褪黑素的生理作用，帮助人体调节睡眠周期，改善睡眠质量，于2005年7月通过美国食品药品监督管理局批准上市，是目前治疗难以入睡型失眠症的首选药物，也是首个没有列为特殊管制的非成瘾失眠症治疗药物。雷美替胺化学式为C₁₆H₂₁NO₂，化学名称是(S)-N-[2-(1,6,7,8-四氢-2H-茚并-[5,4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺，雷美替胺对映异构体与雷美替胺呈镜像对称，化学名称为(R)-N-[2-(1,6,7,8-四氢-2H-茚并[5,4-b]呋喃-8-基)乙基]丙酰胺，雷美替胺对映异构体体内活性较弱，不良反应也未知，存在较大的安全隐患^[1-11]。

随着生活节奏的加快与老年化的加速，睡眠障碍也已经严重影响了人们的正常生活与工作，主要表现为乏力、困倦、精力不集中与免疫力低下等，据相关统计数据显示，我国睡眠质量问题的人群越来越多，年龄也趋于年轻化^[13-17]。而雷美替胺相关制剂在国外上市多年，其被证实能有效改善睡眠质量，提高生活水平质量，我国部分地区也有应用。目前，国内还没有雷美替胺相关制剂上市，也没有现行通用的国家标准，国内生产雷美替胺原料药的厂家较多，研制的仿制药品也多在临床研究阶段，该方法旨在建立高效液相色谱法测定雷美替胺原料药与雷美替胺片中雷美替胺与其对映异构体的含量，为雷美替胺相关制剂中有关物质研究与质量标准的建立优化提供参考。

1仪器与试剂

1.1仪器：岛津LC-10A高效液相色谱仪，N2000色谱工作站；赛默飞U3000高效液相色谱仪，Chromeleon色谱工作站；梅特勒XP205电子天平（瑞士梅特勒托利多公司，精度0.01mg）；深圳洁盟设备有限公司JM-30D超声仪；美国密理博Milli-Q 超纯水机。

1.2试药：雷美替胺与雷美替胺对映异构体(武汉魏氏试剂，纯度均大于99.5%)；正己烷与无水乙醇均为MERCK公司生产色谱纯级试剂，甲磺酸为分析纯；水为自制超纯水。雷美替胺原料药样品（北京某药厂，批号分别为2019L10005、2019L11002）与雷美替胺片（为日本进口药品，批号为118802834，118802855，规格为8mg/片）。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：采用手性柱DAICEL AD-H（4.6mm×250mm, 5μm）；流动相：正己烷-乙醇-甲磺酸（900:100:0.1，体积比)为流动相；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm，进样量：10μl。

2.2对照品溶液制备

取雷美替胺、雷美替胺对映异构体各约10mg，精密称定，置于100ml量瓶中，加正己烷-乙醇（60:40）适量，超声使雷美替胺与雷美替胺对映异构体溶解，放冷，并用正己烷-乙醇（60:40）稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置于100ml量瓶中，加正己烷-乙醇（60:40）稀释至刻度，制成每1ml中约含雷美替胺与雷美替胺对映异构体为5μg的溶液，作为对照品溶液。

2.3供试品溶液制备

取供试品样品适量，精密称定，置100ml量瓶中，加正己烷-乙醇（60:40）适量，超声使雷美替胺溶解，放冷，加正己烷-乙醇（60:40）稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，加正己烷-乙醇（60:40）适量稀释制成每1ml中约含雷美替胺为5μg的溶液，作为供试品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1干扰试验

取供试样品适量、取稀释溶液正己烷-乙醇（60:40），按“2.3”项下制备方法制备供试品溶液与空白阴性样品溶液，并精密量取供试品溶液、空白阴性样品溶液与“2.2”项下的对照品溶液适量，按“2.1”项下条件依法进校测定，记录色谱图，色谱图对比结果表明空白阴性样品溶液对样品溶液两主峰的测定无干扰，且对照品溶液色谱图中雷美替胺与雷美替胺对映异构体保留时间适中，分离度符合要求，峰型较好。测定色谱图见图1和图2。

图1空白阴性样品溶剂干扰试验色谱图

Fig.1 Chromatogram of the solvent interference test for blank negative samples

图2 对照品溶液色谱图

Fig. 2 Chromatogram of the reference solution

2.4.2线性关系与定量限考察

取雷美替胺及雷美替胺对映异构体对照品各适量，精密称定，置于250ml量瓶中，加正己烷-乙醇（60:40）适量，超声使雷美替胺与雷美替胺对映异构体溶解，放冷，并用正己烷-乙醇（60:40）稀释至刻度，摇匀，加正己烷-乙醇（60:40）稀释制成每1ml中各约含雷美替胺及雷美替胺对映异构体均为40μg的溶液，作为对照品贮备溶液；再精密量取对照品贮备溶液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10ml，分别置于20ml量瓶中，加正己烷-乙醇（60:40）稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，分别以对照品的浓度为横坐标，以两主峰的峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，并计算相关系数。另精密移取雷美替胺及雷美替胺对映异构体的混合对照品溶液，加正己烷-乙醇（60:40）多次稀释至较低浓度，按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，直至两主峰的信噪比（S/N）约为10时，确定此时的样品溶液中雷美替胺及雷美替胺对映异构体的浓度为各自方法定量限。标准曲线方程与定量限测定结果见表1。

表1 线性关系与定量限考察结果

Table 1 Linear relationship and limit of quantitation

样品名称	雷美替胺	雷美替胺对映异构体
线性方程	A=0.2878C+0.0252	A=0.2790C-0.0388
浓度范围	0.20μg/ml～20.20μg/ml	0.20μg/ml～19.67μg/ml
相关系数	0.9998	0.9999
定量限（S/N≥10）	2.0ng/ml	2.0ng/ml

2.4.3系统精密度试验

取雷美替胺与雷美替胺对映异构体混合对照品溶液（5μg/ml）做为系统精密度试验溶液，按“2.1”项下液相色谱条件，重复进样测定6次峰面积，记录色谱图峰面积值并计算，雷美替胺与雷美替胺对映异构体的色谱图峰面积的RSD分别为0.89%、0.71%（n=6）。

2.4.4稳定性试验

按“2.2”项下方法制备供试品溶液于室温下放置，分别在0，2，6，12，24h取样，并加入适量雷美替胺对映异构体对照品溶液，制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图峰面积值并计算，雷美替胺与雷美替胺对映异构体的色谱图峰面积的RSD分别为1.25%、1.60%（n=6）。结果表明，该分析方法的供试品溶液室温条件下24h内稳定性良好。

2.4.5重复性试验

取供试样品雷美替胺片适量，依“2.2”项下方法，并加入适量雷美替胺对映异构体对照品溶液，制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图保留时间与主峰面积，并分别通过两成分的线性回归方程计算雷美替胺片中雷美替胺与雷美替胺对映异构体的含量，雷美替胺主峰保留时间的RSD为0.1%，含量的RSD为1.7%；雷美替胺对映异构体主峰保留时间的RSD为0.1%，含量的RSD为2.2%。

2.4.6加样回收率试验

取已知含量的供试品溶液2ml，共9份，平均分为3组，分别置于10ml量瓶中，每组分别加入雷美替胺、雷美替胺对映异构体的混合对照品溶液（含雷美替胺与雷美替胺对映异构体均为40μg/ml）1ml、2ml与3ml，加正己烷-乙醇（60:40）溶解并稀释至刻度，摇匀，制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录两主峰的色谱图，并分别通过两成分的线性回归方程计算供试品溶液中雷美替胺与雷美替胺对映异构体的含量，并将实测值与加样理论值比较，计算雷美替胺与雷美替胺对映异构体的平均回收率分别为99.00%（RSD=1.01%），99.02%（RSD=0.33%）（n=9），测定结果见表2和表3。

表2 雷美替胺加标回收率结果（n=9）

Table 2 Results of recovery rate of ramelteon（n=9）

序号	加入量/μg	检出量/μg	加收率/%	平均加收率/%	RSD/%
1	40.41	40.32	99.78	99.00	1.01
2	40.41	40.07	99.16
3	40.41	40.11	99.26
4	80.82	79.04	97.80
5	80.82	81.06	100.30
6	80.82	80.03	99.02
7	121.23	118.95	98.12
8	121.23	118.21	97.51
9	121.23	121.32	100.07

表3 雷美替胺对映异构体加标回收率结果（n=9）

Table 3 Results of recovery rate of ramelteon enantiomer（n=9）

序号	加入量/μg	检出量/μg	加收率/%	平均加收率/%	RSD/%
1	40.84	40.45	99.05	99.02	0.33
2	40.84	40.48	99.12
3	40.84	40.49	99.14
4	81.68	81.04	99.22
5	81.68	80.49	98.54
6	81.68	81.01	99.18
7	122.52	120.71	98.52
8	122.52	121.11	98.85
9	122.52	121.96	99.54

2.5样品测定

取样品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并计算各样品中雷美替胺与雷美替胺对映异构体的含量。测定结果见表2。

表2含量测定结果（n=3）

Table 2 Content determination results (n=3)

批号	雷美替胺	对映异构体
2019L10005	99.67%	0.02%
2019L11002	99.85%	0.03%
118802834	101.24%	未检出
118802855	99.58%	未检出

3讨论：

3.1 色谱条件的选择^[18-21]：取雷美替胺及雷美替胺对映异构体的乙醇溶液于200nm～400nm波长范围内进行紫外扫描，结果表明雷美替胺及雷美替胺对映异构体最大吸收波长均在288nm附近，但是在288nm波长处，供试品溶液中其他杂质与降解产物的紫外吸收对含量测定的干扰较大，因此最终选用两者紫外吸收较大的220nm作为雷美替胺与雷美替胺对映异构体含量测定的色谱分析检测波长。此外，该实验还分别比较了检测波长220nm±5nm、流动相配比变化5％、柱温变化±5℃及流速相对值变化±20％时，色谱图变化情况，结果发现在该实验采用的色谱条件下，两主峰的拖尾因子、分离度均符合规定要求，峰形较好，方法耐用性好。

3.2方法学考察：目前市售的雷美替胺原料药与相关制剂较少，原料药与片剂中雷美替胺对映异构体量含量很少或是没法检出，无法对雷美替胺对映异构体准确检测与定量，因此在稳定性、重复性与加样回收率试验过程中在制备供试品溶液时，均加入适量雷美替胺对映异构体，使供试品溶液中雷美替胺及雷美替胺对映异构体处于相当浓度，以便提高方法学考察试验中相关数据的可靠性。

3.3 标准考察：目前，雷美替胺相关制剂多为日本进口，为日本武田公司生产的雷美替胺片，而在国内还未有雷美替胺相关制剂上市销售，也还没有相关的国家标准，但国内原料药厂家较多，原料药中的杂质与代谢产物有差异，制定的标准也有很大不同，其中雷美替胺与雷美替胺雷美替胺对映异构体的分离难度较大，有关物质与定量过程中容易相互干扰影响，因此研究与分析雷美替胺及其雷美替胺对映异构体的含量测定方法就显得更有意义。

参考文献：

[1] 钟雅妮,王征,朱柏任,等.2种雷美替胺杂质的制备与结构确证[J].药物化学, 2020,36(1):24-25.

[2] 毛 化,钟静芬,时惠麟．雷美替胺合成路线图解[J].中国医药工业杂志,2010,41(10):783-785．

[3] 刘发明,苏佳鹏,范为正,等.手性胺拆分法制备雷美替胺[J].合成化学,2015, 23(3):264-265.

[4] 张杰,李国贤,罗宏军,等.雷美替胺有关物质的合成[J].广东化工,2016,24(43):60-61.

[5] 张 杰,李国贤,乔 萍,等.雷美替胺降解杂质的制备[J].中国医药工业杂志,2017,48(6):833-834.

[6] 邾枝花,黄 平,周月乔.雷美替胺的合成路线改进[J].化学世界,2020,61(7):472-475.

[7] 胡延雷,杜建成,陈 超,等.雷美替胺有关物质的合成[J].中国医药工业杂志,2015,46(6):566-568.

[8] 李国贤,张 杰,罗宏军,等.手性拆分法制备雷美替胺关键中间体(S)-2-(1,6,7,8-四氢-2H-茚并［5,4-b］呋喃-8-基)乙胺[J].合成化学,2019,27(3):225-228.

[9] 丁 胜,王 娜,周 亭,等.雷美替胺中间体拆分副产物的消旋化[J].中国医药工业杂志,2016,47(5):531-532.

[10] Kansal V, Mistry D, Vasoya S. Process for the synthesis of ramelteon and its intermediates:WO, 2010045565 [P].2010-04-22.

[11] KOIKE T,HOASHI Y,TAKAI T,etal.1,6-dihydro-2H-indeno[5，4-b] furan derivatives: design, synthesis, and pharmacological characterization of a novel class of highly potent MT2-selective agonists[J]. J Med Chem,2011,54( 9):3436-3444．

[12] 周俊翔,吴逢波,唐 尧.雷美替胺治疗成人慢性失眠的系统评价[J].中国循证医学杂志，2012，12(3):314-319．

[13] 刘奥博,汤永红.老年慢性失眠症治疗研究进展[J].世界睡眠医学杂志,2021,8(2)：367-368.

[14] 张如意,王平,张舜波,等.褪黑素治疗睡眠障碍的作用机制探讨[J].中华中医药学刊,2018,36(2):308-309.

[15] 周俊翔,余文韬,吴斌,等.雷美替胺治疗老年人慢性原发性失眠症的系统评价[J].中国药房,2011,22(38):3593-3595.

[16] 叶敏,吕林,徐啸晨.治疗失眠症新药雷美替胺[J].中国新药杂志,2006,15(15):1309.

[17] 张萌.具有新的作用机制的安眠药: 雷美替胺[J].河北医药,2009,31(12):1509．

[18] 周琴芹,邹巧根,曲 影,等.反相高效液相色谱法测定雷美替胺的含量及有关物质[J].沈阳药科大学学报, 2014, 31( 3):197-198.

[19] 刘莉,胡华胜.雷美替胺片溶出度方法的建立[J].药学研究,2018,37(1):31-32.

[20] 张 琳,刘葵葵,李 欣,等.相似因子法评价雷美替胺片自研制剂与原研制剂溶出曲线的相似性[J].中国药房,2016,27(30):4307-4308.

[21]王 玲,王玉江,周青,等.气－质联用法测定人血浆中雷美替胺的浓度和临床应用[J].中国医院药学杂志,2020,40(22):2322-2324.

订阅方式：
①在线订阅（推荐）：www.sdchem.net.cn
②邮局订阅：邮发代号24-109

投稿方式：
①在线投稿（推荐）：www.sdchem.net.cn
　　作者只需要简单注册获得用户名和密码后，就可随时进行投稿、查稿，全程跟踪稿件的发表过程，使您的论文发表更加方便、快捷、透明、高效。
②邮箱投稿：sdhgtg@163.com sdhg@sdchem.net
　　若“在线投稿”不成功，可使用邮箱投稿，投稿邮件主题：第一作者名字/稿件题目。
投稿时请注意以下事项：
　　①文前应有中英文“题目”、“作者姓名”、“单位”、“邮编”、“摘要”、“关键词”；
　　②作者简介包括：姓名、出生年、性别、民族、籍贯或出生地、工作单位、职务或职称、学位、研究方向；
　　③论文末应附“参考文献”，执行国标GB/T7714-2005标准，“参考文献”序号应与论文中出现的顺序相符；
　　④注明作者的联系方式，包括电话、E-mail、详细的通讯地址、邮编，以便联系并邮寄杂志。
　　 　                                                                                   山东化工稿件修改细则