富马酸伏诺拉生中基因毒性杂质吡啶-3-磺酸甲酯含量的测定

　　

富马酸伏诺拉生中基因毒性杂质吡啶-3-磺酸甲酯含量的测定

刘杰，孙艳阁，孙继国，李佳璐，刘效军

（寿光富康制药有限公司，山东寿光 262700）

摘要：目的：建立高效液相色谱（HPLC）法测定富马酸伏诺拉生中基因毒性杂质吡啶-3-磺酸甲酯，并通过方法学验证该方法的可行性。方法：采用色谱柱Phenomenex Biphenyl（250mm×4.6mm，5μm），以pH3.0磷酸二氢钾溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速为1.0 ml/min，进行梯度洗脱，检测波长为262 nm，柱温为20 ℃，进样量为20 μl。结果：该色谱条件下，吡啶-3-磺酸甲酯专属性良好，检测限度（5.37ng/ml）低，线性关系在0.018-0.198μg/ml范围内良好，平均加样回收率为99.7%，RSD为0.89%，符合实验要求。结论：本方法简便、准确、易于操作，可用于富马酸伏诺拉生中基因毒性杂质吡啶-3-磺酸甲酯的检测。

关键词：高效液相色谱法；富马酸伏诺拉生；吡啶-3-磺酸甲酯

Determination of Genotoxic Impurity Methyl Pyridine-3-Sulfonate in Vonoprazan Fumarate

LIU Jie，SUN Yan-ge，SUN Ji-guo，Li Jia-lu，LIU Xiao-jun

(Shouguang Fukang Pharmaceutical Co.,Ltd,Shouguang 262700)

Abstract: Objective To establish a HPLC method for the determination of genotoxic impurity methyl pyridine-3-sulfonate in Vonoprazan Fumarate, and the feasibility of the method was verified through methodology. Methods The separation was performed on the Phenomenex Biphenyl column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with pH 3.0 potassium dihydrogen phosphate solution as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B by gradient elution at the detection wavelength of 262 nm, the column temperature was carried out at 20 ℃, the flow rate was 1.0 ml/min and the injection volume was 20 μl. Results Under the selected chromatographic conditions, the specificity was fine, the detection limit (5.37ng/ml) was low, the linear relationship was good in the range of 0.018-0.198 μg/ml, and the average recovery rate was 99.7% with RSD 0.89%, which meets the experimental requirements. Conclusion The method is simple, accurate, and easy to operate. It can be used for the detection of genotoxic impurity methyl pyridine-3-sulfonate in Vonoprazan Fumarate.

Key words: HPLC; Vonoprazan Fumarate; methyl pyridine-3-sulfonate

富马酸伏诺拉生是一种新型钾离子通道阻滞剂，用于治疗非糜烂性胃食管反流病、十二指肠溃疡、胃溃疡、糜烂性食管炎（治愈及维持治疗），由日本武田制药研发，于2014年12月首次在日本上市^[1~5]。吡啶-3-磺酸甲酯是富马酸伏诺拉生合成物料吡啶-3-磺酰氯水解产物吡啶-3-磺酸与溶剂甲醇反应产生，属于基因毒性物质，根据欧洲医药评价署《遗传毒性杂质限度指导原则》，吡啶-3-磺酸甲酯的每日摄入量限值为1.5μg，根据人用药品注册技术要求国际协调会议( ICH) 的指导原则，吡啶-3-磺酸甲酯的限度设为0.006%。参照相关文献^[6~10]，制定了吡啶-3-磺酸甲酯的液相检测方法。

1 仪器与试药

仪器： 1260Ⅱ高效液相色谱仪（美国Agilent公司），采用二极管阵列检测器；XP105DR电子分析天平（梅特勒-托利多公司），PHS-3C酸度计（上海雷磁）。

富马酸伏诺拉生样品（批号Z-032032109001、Z-032032109002、Z-032032109003，寿光富康制药有限公司）；吡啶-3-磺酸甲酯对照品（批号20-V3092-02，RXA公司）；乙腈（批号181195，色谱纯，Fisher公司）；磷酸二氢钾（批号SLCC7596）、磷酸（批号STBG5467）均为分析纯，均购自SIGMA公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Biphenyl（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A：0.01mol/l磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至3.0），流动相B：乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1；溶媒：50%的乙腈-水溶液；检测波长：262nm；色谱柱温度：20℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。

表1 流动相梯度洗脱程序

时间/min	流动相 A/%	流动相B/%
0	90	10
5	90	10
15	70	30
25	70	30

2.2 溶液制备

对照品贮备液：取吡啶-3-磺酸甲酯对照品约18mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶媒溶解并稀释至刻度，精密量取1ml至200ml量瓶中，用溶媒溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品贮备液。

对照品溶液：精密量取对照品贮备液10ml，置50ml量瓶中，用溶媒溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。

供试品溶液：取富马酸伏诺拉生样品约30mg，精密称定，置10ml量瓶中，用溶媒溶解并稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。

2.3 专属性试验

称取富马酸伏诺拉生样品约30mg，置于10ml量瓶中，加入“2.2”项下对照品贮备液2ml，用溶媒溶解并稀释至刻度，摇匀，得到混合溶液。分别取溶媒、对照品溶液、供试品溶液和混合溶液各20μl，注入液相色谱仪，色谱图见图1-4。

结果：该色谱条件下，空白溶剂中峰为梯度峰，并对对照品色谱图中的特定峰无干扰。供试品及混合溶液色谱图表明富马酸伏诺拉生的各杂质峰在吡啶-3-磺酸甲酯附近无干扰，分离度达到要求，本方法能满足本品测定要求。

图1 空白溶剂HPLC色谱图

图2 对照品HPLC色谱图

图3 供试品HPLC色谱图

图4 混合溶液HPLC色谱图

2.4 检测限与定量限试验

取“2.2”项下的对照品溶液，逐级稀释，通过色谱图得知，吡啶-3-磺酸甲酯的定量限浓度为16.11ng/ml, 将此溶液连续进样6次，峰面积的RSD为5.54%；定量限溶液继续稀释，吡啶-3-磺酸甲酯的检测限浓度为5.37ng/ml，能满足吡啶-3-磺酸甲酯的测定。

2.5 线性关系考察

精密量取“2.2”项下的对照品贮备液1ml、3ml、6ml、8ml、10ml及11ml，分别置于50ml量瓶中，用溶媒稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.018-0.198μg/ml的线性溶液。按“2.1”项下条件进行测定，记录色谱图，以对照品浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得线性方程Y=27.703X-0.0367，相关系数r=0.999；表明吡啶-3-磺酸甲酯在0.018-0.198μg/ml浓度范围内线性良好。

2.6 重复性试验

取富马酸伏诺拉生样品约30mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入2ml对照品贮备液，用溶媒溶解并稀释至刻度，同法配制6份，按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，通过计算可得，重复性试验下混合溶液中吡啶-3-磺酸甲酯峰面积RSD为1.51%，说明本法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取富马酸伏诺拉生样品约30mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入2ml对照品贮备液，用溶媒溶解并稀释至刻度，室温放置，将此混合溶液分别于0h, 2h, 4h, 8h, 12h, 16h, 20 h取样，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，通过计算可得，混合溶液中吡啶-3-磺酸甲酯峰面积的RSD为1.02%，表明此溶液在20h内稳定性良好。

2.8 加样回收试验

按照“2.2”项下的要求配制3份对照品贮备液和对照品溶液。精密称取富马酸伏诺拉生约30mg，置10ml量瓶中，分别加入对照品贮备液1ml、2ml、3ml，用溶媒溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为50%、100%、150%的回收率溶液，各浓度回收率溶液同法配制3份。分别取对照品溶液、供试品溶液和各浓度回收率溶液20μl，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，按照外标法进行计算，结果见表2。

表2 加样回收试验结果

回收率溶液	称样量/mg	加入量/μg	样品含量/μg	测得量/μg	回收率	平均值	RSD
50%	30.32	0.895	0	0.904	101.01%
	30.29	0.899	0	0.895	99.56%
	30.35	0.896	0	0.904	100.89%
100%	30.31	1.79	0	1.78	99.44%
	30.28	1.797	0	1.769	98.44%	99.66%	0.87%
	30.30	1.791	0	1.795	100.22%
150%	30.37	2.685	0	2.662	99.14%
	30.34	2.696	0	2.67	99.04%
	30.36	2.687	0	2.665	99.18%

通过表2可知，吡啶-3-磺酸甲酯的平均回收率为99.66%，RSD为0.87%，说明本方法回收率良好。

2.9 耐用性试验

取富马酸伏诺拉生样品约30mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入2ml对照品贮备液，用溶媒溶解并稀释至刻度，摇匀。按照“2.1”项下的条件进行测定，记录色谱图，计算结果见表3。

表3 耐用性试验结果

色谱条件的改变	色谱条件	含量/%
未改变	原条件	0.0055
改变流速	流速0.9 ml/min	0.0054
	流速1.1 ml/min	0.0055
改变柱温	柱温15℃	0.0054
	柱温25℃	0.0056
改变pH值	pH值2.8	0.0053
	pH值3.2	0.0054

通过分析以上耐用性数据可知，当色谱条件发生轻微变化时，吡啶-3-磺酸甲酯的分离度仍符合要求，检测结果相差不大，因此可以认为该色谱条件耐用性良好。

2.10 样品测定

按“2.2”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，并以外标法计算吡啶-3-磺酸甲酯的含量，结果3批样品均未检出吡啶-3-磺酸甲酯。

3 小结

吡啶-3-磺酸甲酯是富马酸伏诺拉生起始物料吡啶-3-磺酰氯在反应过程中水解产物吡啶-3-磺酸与甲醇的反应产物，是一种基因毒性杂质。由于合成工艺中用到甲醇溶剂，故此反应发生几率高，基于以上原因建立了吡啶-3-磺酸甲酯的测定方法，并对该方法进行了系统的方法学验证，结果表明该方法的专属性良好，重复性、定量限和检测限、线性、溶液稳定性、回收率和耐用性都符合要求，适用于富马酸伏诺拉生中吡啶-3-磺酸甲酯的检测。

参考文献

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