β-环糊精固定相研究进展及其在液相色谱中的应用
李超, 郭文杰, 曹娜, 蒋寿剑, 刘利民, 李洋*
（正大天晴药业集团股份有限公司南京研究院，南京，211100）
【摘 要】 固定相是影响样品进行液相色谱分析分离的关键因素，使用β-环糊精作为固定相，因其特殊空腔结构和良好的手性拆分能力而应用广泛，本文总结了近年来β-环糊精作为固定相研究的最新进展，及其在药物、农药、食品等领域的应用，以期为β-环糊精作为固定相的开发制备和应用做借鉴参考。
【关键词】 β-环糊精；手性固定相；高效液相
Research progress of β-cyclodextrin bonded stationary phases and chiral separation in HPLC
LI Chao, GUO Wen jie, CAO Na, JIANG Shou jian, LIU Li min, LI Yang*
( Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co, Ltd., Nanjing 211100 )
【Abstract】 Stationary phases is a key factor affecting the separation of HPLC. The β-cyclodextrin bonded stationary phases is widely used because of its special cavity structure and good chiral resolution ability. This paper summarizes research progress of β-cyclodextrin bonded stationary phases and its application in separation of drugs, pesticides and food by HPLC, in order to guide the preparation and application of β-cyclodextrin bonded stationary phases.
【Key words】 β-cyclodextrin；chiral stationary phase；HPLC
小分子对映体拆分包括色谱法，化学方法，结晶等技术手段，高效液相色谱法因具有分离效率高、灵敏度高、选择性高等特点，已成为对映体拆分的一种重要色谱分离技术。为了拆分众多的手性化合物，研究人员相继合成了多种手性固定相，代表类型包括：环糊精型，多糖型，蛋白质型，冠醚型，刷型，以及大环抗生素型等。
最广泛应用的手性固定相之一—环糊精类受刑固定相，是一种由α-1, 4-糖苷键与多个葡萄糖单元连接构成的超分子化合物，它腔体结构特殊，能通过多种作用力与结构大小合适的目标分子发生包结作用，从而产生良好的手性分离功能。三种常见的环糊精（α, β, γ-CD）包含数目不同的葡萄糖分子，分子尺寸由小到大进行排列，往往表现出的物理、化学性质各不相同。最常用的为β-环糊精（β-CD），其结构中共有7个葡萄糖分子，每个葡萄糖分子中包含5个手性碳，因此β-CD 中共有35个手性中心。它对多取代苯环、萘环和多种化合物具有包结作用，而α-CD一般只能包结单取代苯环和萘环，γ-CD主要包结萜类，而且β-CD 价格较优惠，空腔大小适中，制备成本低，拆分能力好。本文主要针对β-环糊精手性固定相近年来结构改造情况及其应用进行综述。
图1. β-环糊精结构
1 β-环糊精固定相研究进展
β-环糊精(β-Cyclodextrin, β-CD)的分子形状类似圆台，外表面具有亲水性，内部空腔有疏水性。早期开发的环糊精固定相不耐高压，机械强度差，近年来，又研制了一些新的衍生型环糊精键合相，以达到目的：（1）适用于多种分离模式，如正相、反相色谱；（2）溶剂中溶解性的提高；（3）环糊精与客体分子间的相互作用力为强作用力；（4）通过不同的衍生化基团，进而选择性识别客体分子；（5）改善传统环糊精手性对映体分析范围较小的不足。研究主要围绕着以下两个方向进行：（1）新型改性环糊精的合成；（2）键合臂及键合方式的开发。
1.1新型改性环糊精键合相
（1）π-酸性/π-碱性芳基取代型
新型改性环糊精键合相的手性拆分能力来自于π-π作用。其中π-酸类易分离π-碱性芳基手性化合物，而π-碱类对π-酸性芳基取代物拆分效果更好。Lai等[1]制备了3 种π-碱型键合相，尝试了各种对映体进行验证，其手性拆分能力与其键合量正相关。π-碱类在苯环取代型环糊精固定相中较常见，而π-酸性芳基取代基团不易键合到环糊精端口，针对缺陷，Zhang等[2]将醚键作为基团，π-酸性的硝基苯键合到环糊精上，利用同样的键合方法制备并系统对比了9种π-酸类环糊精键合固定相的色谱拆分性能。王惠等[3]通过三氟甲基苯基异氰酸酯、间氯苯基异氰酸酯和3, 5 -二甲基苯基异氰酸酯的活泼异氰酸基与氨基环糊精的反应，制备并表征了三种π-酸和π-碱型芳脲基衍生化环糊精键合硅胶手性固定相，研究发现三唑类和洛尔类碱性药物在三氟甲基苯脲环糊精固定相上有较好的分离。
（2）带电荷型
环糊精的带电荷型手性键合相与手性化合物发生离子交换作用、氢键作用和静电作用等，获得并优化了拆分能力。Stalcup 等[4]开发了磺酸化的负电荷型β-环糊精手性固定相，这种衍生环糊精手性固定相在反相条件下，成功分离了33种手性药物。Wang 等[5]利用自由基共聚反应，采用自由基共聚法分别将带正电荷的季胺基和咪唑基引入到环糊精端口再连接至硅胶上，合成的正电荷型固定相，在正相模式下，对多种手性羧酸和手性药物有较好的拆分效果。相对于强正、负电荷型的研究，弱离子化基团的引入较为少见，曾春等[6]首次制备了一种离子化程度较弱的固定相，将苯硼酸引入到乙二胺β-环糊精端口，并用其对多种黄酮类化合物、β-受体阻滞剂和三唑类杀菌剂进行拆分研究，结果表明，该类型的键合相对目标分子具有的空腔包结作用，氢键作用，π-π和空间位阻作用，这都是手性分离的重要因素，其使用范围广泛。
（3）桥联型
使用功能基团对两个以上的环糊精进行联接，所得有机整体为一种新型的超分子化合物——桥联环糊精。Zhou等[7]使用乙二胺桥联两个β-环糊精，并键合SBA-15的固定相用于手性拆分。针对目前临床上大量使用的十几种心血管药物β-受体阻滞剂对映体，新型桥联型环糊精衍生物固定相成功地的在极性有机溶剂体下对对映体进行了拆分，其中，其中有些分离度达到了2.0以上，例如普萘洛尔2.18、卡维地洛2.01，分离所用总时间一般在10~20 min，分离效率很好。赵杰等[8]制备了一种新型复式环糊精固定相，其是先在硅胶表面键合一层天然环糊精，再通过点击化学的手段，利用三唑桥结构与底层环糊精相连引入另一层天然或苯胺基酰基衍生化环糊精，形成复式的结构。
从以下几个方面对单层环糊精固定相和复式环糊精固定相的实用性进行比较：对手性对映体的包合作用、对异构体的手性识别能力、固体提取、样品富集；由实验结果可得，反向串联的环糊精双分子层结构具有更好的性质和更大的潜力。这方面的研究虽刚起步，但正受到越来越多的重视。
（4）超分子杂合类
以杯芳烃或冠醚等作为主体分子与β-CD偶联得到新的衍生型超分子杂合类固定相，在这种固定相中，所用的两种主体超分子有协同效应，增强识别客体的能力，表现出优越的识别性。Zhao等[10]将环糊精分别与万古霉素和利福霉素进行偶联合成了两种杂合类β-环糊精固定相，通过实验发现，大多数难以拆分的手性物质如抗炎药、氨基酸、β-blockers通过两种固定相都能实现分离，但是这类固定相制备较难。王惠等[3]将胆固醇引入到环糊精端口，一方面改善环糊精外腔的亲水性，另一方面保留空腔的包结作用使之同时具有手性和非手性化合物的分离功能并能在多模式下使用。
常用的衍生基团有：3,5-二甲基苯基异氰酸基、甲基、乙酰基等，其强疏水性的特点，有利于小分子化合物反相条件下的拆分。但同时其端口连接的众多衍生化基团又可能会影响溶质分子进入环糊精腔体，固定相无法发挥较好的包结作用，特别是大体积的配体结构可能会堵塞硅胶孔道，其手性识别性能往往受限。部分衍生化因其他工艺复杂，结构多变，实际研究并不多见。
单衍生型是指先衍生化，再键合到硅胶，通常为环糊精6位羟基衍生化。这种方式的优点为：配体结构明确，方法简便、重现性好、性能稳定。全衍生化环糊精会出现端口拥堵问题，在裸环糊精上增加一定的疏水性和新的作用位点，可避免这种情况发生，能够充分发挥腔体包结作用和端口的协同作用，增强手性分离能力。
1.2 新型键合臂及键合方式的开发
鉴于涂覆型填料稳定性不佳，现多通过各种化学间隔基团如胺键、脲键、醚键、叠氮基等将环糊精配体连接至硅胶基质上。氨基键合型手性固定相由Fujimura利用氨丙基硅胶和环糊精脱水反应制取，这类固定相对氨基类手性化合物具备较好的拆分效果，但是容易水解，不稳定。脲键、醚键、叠氮基类键合臂相对较稳定，其中醚键键合的环糊精手性固定相最早由Armstrong开发，通过将环糊精与环氧丙烷反应制得，稳定性较好，已作为商品柱收到广泛应用。近年来多通过点击化学技术以三氮唑将衍生化的环糊精配体与硅胶基质连接，这类键合反应操作简单，合成时间快，稳定耐用且机械性能好，受到广泛应用。Wang 等人[11]采用点击化学的叠氮基-炔基环加成反应在CuI(PPh3)催化下反应制得多种类型的三氮唑β-CD手性键合固定相，对多种手性物质如氨基酸类、丙酸类、黄烷酮类等拆分，效果良好。赵艳艳等[12]基于硅胶基质，制备了两种带有不同间隔臂固定相Click Alkyl-CD和Click OEG-CD，其中Click Alkyl-CD带有十二烷基间隔臂，Click OEG-CD带有四聚乙二醇间隔臂，并对其色谱性能进行了系统评价。
图2. 氨基（A），脲胺（B），醚键（C），叠氮基（D）键合型
2 液相色谱中的环糊精固定相
β-环糊精固定相以其特殊的结构形式可以与不同手性分子作用，被广泛用于手性药物成分，农药，食品，化工原料等方面的分析分离，特别随着不同新型衍生化环糊精固定相填料的出现，相应液相色谱检测方法具有快速高效、易于实现、灵敏度高、定量准确的特点，其应用亦将越来越广泛。
2.1 手性药物分析
液相色谱分析研究中，手性药物对映体拆分具有重要的意义。郑振等[13]以乙酰基-β-环糊精手性柱Astec Cyclobond TMＩ2000AC为固定相，对米那普仑对映体进行分析方法和拆分机理研究，结果对映体分离度可达1.74，该方法具有分离度好、快速、高效、重现性好的优势。分子模拟结果表明环糊精衍生化的乙酰基对不同异构体产生的氢键作用差异是引起手性识别作用的主要原因。在极性有机模式下，廖玉芹等[14]选用自制的乙二胺四乙酸二酰桥联双β-环糊精手性固定相，利用高效液相色谱-荧光法，建立了检测药片中的盐酸阿罗洛尔和阿替洛尔以及血浆中的盐酸阿罗洛尔对映体含量的方法，通过对流动相的成分、流速、温度等色谱条件的优化，对盐酸阿罗洛尔和阿替洛尔对映分离度分别可达1.71和1.52，分析时间均在30min左右。
2.3 农药的分析
随着农药的普遍应用，手性农药的分析检测越来越受关注。张天赐等[15]采用自制的含苯甲酰胺键合臂β-环糊精固定相色谱柱，以乙腈-水=12: 88（V/V）作流动相，检测了苹果和西红柿中腈菌唑对映体含量。双亚洲等[16]以硅胶为基质，将六亚甲基二异氰酸酯与6-脱氧-6-羟乙基胺基-β-环糊精反应，合成二脲基桥联β-环糊精作为键合相，制备一种新型的二脲基桥联β-环糊精固定相，结果显示，仅以甲醇或乙腈-水作流动相，便拆分了25种手性化合物，无需端口衍生化，其中对4′-羟基黄烷酮的分离度高达3. 45。桥联环糊精相对于单层环糊精固定相，具有更高的手性分离能力和较广泛的分离对象。曾春等[17]合成出一种新的单甲基脲-β-环糊精键合有序介孔SBA-15手性固定相，对手性杀菌剂氟三唑对映体进行高效液相色谱分离，以甲醇-水（体积比为40: 60）为流动相，流速为0.5ml/min，柱温为1℃。
2.3 食品的分析
Machonis等[18]采用Astec Cyclobond I-2000 RSP(250×4.6mm,5μm) (Supelco, Bellefonte, PA)作为手性固定相，用乙酸铵缓冲液（PH4.0）-甲醇作为流动相，使用30%的甲醇进行等度洗脱，建立了含可可粉产品中对映体儿茶素和表儿茶素成分的液相分析方法。
2.4 其它方面的应用
Zhu等[19]合成了基于3, 5-二甲基苯基氨甲酰化β-环糊精连接奎宁（QN）或奎尼丁（QD）部分的新型手性选择剂，并将其键合在硅胶上，通过与3, 5-二甲基苯基氨甲酰化β-环糊精手性固定相和9-O（叔丁基氨甲酰）-QN基CSP（QN-AX）相比较，研究了其对Fmoc保护的氨基酸、手性药物氯前列烯醇和中性手性分析物的分离效果，研究发现，QN/QD部分在Fmoc氨基酸的整个对映体分离过程中起主导作用，同时β -CD部分的协同作用，导致β-CD-QN基CSP和β-CD-QD基CSP的对映体分离不同。此外，对于一些中性分析物，新的固定相保留了基于β-CD固定相在正相上的非凡对映体分离，甚至在某些样品上表现出更好的对映体分离。
3 总结与展望
近年来的研究主要集中在：一方面通过对β-环糊精配体进行结构优化，增强其对目标分子空间识别能力，使其具有多重作用位点；另一方面优化键合臂和与基质键合方式，将制备方法变繁为简，使其具有更高的稳定性和实用性。虽然以上各类优化后的β-环糊精固定相通过引入疏水作用、氢键、π-π键及偶极作用等不同程度上改善了其手性选择性、扩大了应用范围，但不同的改性环糊精往往多只能拆分特定类别的对映体，解决其手性拆分的普适性问题仍值得不断深入研究，但好在已有商品化β-环糊精固定相柱在售, 使得环糊精及其衍生化固定相在液相色谱手性对映异构体的分离应用范围越来越广。
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