一种羧酸酯酶荧光探针的设计合成及表征
刘家芳，滕明刚，谢国旺，游辉，柴慧芳*
（贵州中医药大学药学院，贵州
贵阳
550025）
摘要：目的：设计并合成一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针CzCN。方法：以咔唑为起始原料，经过6步化学反应合成目标产物CzCN，并通过1H NMR，HR-MS对其结构进行表征，同时结合光谱实验检测其与羧酸酯酶反应前后的光谱属性。结果：合成的荧光探针CzCN最大吸收波长为420 nm，最大发射波长为580 nm，斯托克斯位移为160 nm；羧酸酯酶可催化CzCN的羧酸酯键发生水解反应，且在水解前后荧光强度发生显著变化。结论：合成的荧光探针CzCN具有较好的光谱属性，可用于羧酸酯酶的检测。
关键词：荧光探针；羧酸酯酶；咔唑
Synthesis
and Characterization of a Carboxylesterase Fluorescent Probe
Liu
Jia-fang, Teng Ming-gang, Xie Guo-wang, You Hui, Chai Hui-fang*
(School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,
Guiyang 550025, China)
Abstract:
Objective : To design and synthesize
a fluorescent probe CzCN for the detection of carboxylesterase. Methods : Using carbazole as the
starting material, the target product CzCN was synthesized through 6-step
chemical reactions, and its structure was characterized by 1H NMR
and HR-MS, and its spectral properties before and after the reaction with
carboxylesterase were detected by spectroscopic experiments. Results: The synthesized fluorescent
probe CzCN had a maximum absorption wavelength of 420 nm, a maximum emission
wavelength of 580 nm, and a Stokes shift of 160 nm. Carboxylesterase could
catalyze the hydrolysis of the carboxylate bond of CzCN. The fluorescence
intensity changed significantly before and after hydrolysis. Conclusion : The
synthesized fluorescent probe CzCN has good spectral properties and can be used
for the detection of carboxylesterase.
Keywords: fluorescent
probe; carboxylesterase; carbazole
酶大量存在于人体内，对许多生理过程起到催化作用，而且在生物稳态和代谢防御系统中也起着至关重要的作用。大量研究表明，酶活性的异常与癌症和代谢性疾病在内的多种疾病的发生、发展直接相关，且部分酶己确定为相关疾病的关键标志物。
羧酸酯酶（carboxylesterase,
CES）是一种广泛存在于哺乳动物体内的α/β折叠水解酶超家族蛋白。该超家族蛋白具有高度保守的氨基酸催化三联体，能高效催化水解包括环境毒物及药物在内的多种内源性与外源性物质，主要水解羧酸酯、硫酯、氨基甲酸酯和酰胺等酯类物质[1-2]。根据氨基酸排列顺序，可将CES大致分为5类，人体中主要存在人羧酸酯酶1（CES1）与人羧酸酯酶2（CES2），两者均参与了人体重要的生理过程[3-4]。在体内分布上，CES1主要集中于肝脏、单核巨噬细胞和肺上皮细胞，在其他组织中的含量低；而HCE2则主要集中于肠道，在肝脏也有分布[5]。作为一种发挥重要功能的代谢酶，大量研究表明羧酸酯酶在体内浓度的异常与多种疾病相关，如动脉粥样硬化、高脂血症、癌症（如肝癌、乳腺癌、子宫癌）等[6-8]。羧酸酯酶可根据其水解特性将一些难溶性的羧酸盐类前药通过水解反应释放出有效的药物，其次，由于羧酸酯酶具有高催化效率及高特异性，还可以调节各种代谢功能（酯类物质代谢、基因表达、物质运输和解毒等）[9]。因此，发展检测羧酸酯酶活性的分析方法对癌症的早期诊断与生物医药的研究都具有非常重要的意义。
到目前为至，已报道的检测羧酸酯酶的技术有很多，主要包括色谱技术[10]、蛋白质重组技术[11]、化学发光技术[12]、蛋白免疫印迹技术[13]等，但这些检测技术花费昂贵且费时费力，与上述检测方法相比，荧光探针具有花费少、灵敏度高、响应速度快等优点而备受关注。
荧光探针系能够与被分析物相互作用并伴随其光谱性质的变化来确定被分析物的物质，一般由三部分组成，即荧光团、连接臂和识别基团，也有一些荧光探针只包括荧光团和识别基团。其中荧光团是荧光探针的关键组成部分，它是指在一定光源激发下能够发出荧光的有机分子，一般具有大的共轭体系和刚性的平面结构，其自身固有的光化学性质对荧光探针的识别特点和性能起关键作用[14]。根据作用机制的不同，可将荧光探针分为光诱导电子转移（PET）、分子内电子转移（ICT）、荧光共振能量转移（FRET）以及聚集诱导发光（AIE）等不同的类型[15]。
咔唑，又名9-氮（杂）芴，是一种白色单斜片状晶体，具有特殊气味，咔唑类化合物常作为探针合成的起始原料之一[16-19]，其具有良好的化学反应活性，是一种重要的含氮杂环有机中间体，可以直接通过1、3、6、8、9位的活性位点发生硝化、卤化、傅克反应生成各种咔唑衍生物。咔唑及其衍生物由于分子结构具有较大的共轭平面，优良的电子给体性能，电子流动性强，良好的光稳定性和热稳定性能，除用于染料、医药和农药合成的传统用途外，也被广泛用于合成光电功能材料[20-21]。
本文基于咔唑设计并合成了一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针CzCN，首先以咔唑（图1，a）为起始原料，经甲基化得9-N甲基咔唑（图1，b），再经过反应得到3-醛基-9-N甲基咔唑（图1，c），经过溴化得到3-醛基-6-溴-9-N甲基咔唑（图1，d），通过（d）合成得到3-醛基6-羟基-9-N甲基咔唑（图1，e），再通过缩合得到化合物（图1，f），最后通过酯化得到荧光探针CzCN，并通过光谱试验等验证了其具有较好的光谱属性。
图1 荧光探针CzCN的合成路线
Fig.1
Synthesis route of fluorescent probe CzCN
1
实验部分
1.1
仪器与试剂
1.1.1 仪器 DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；OSB-2200油浴锅（上海爱郎仪器有限公司）；78-1磁力搅拌器（金坛市易晨仪器制造有限公司）；FA22204B电子天平（万分之一，上海天美天平仪器有限公司）；Bruker 400MHz型核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；N1200旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；TU-1810型紫外分光光度计（北京普析）；F-98型荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司）。
1.1.2 试剂 咔唑、氢化钠、碘甲烷、氢氧化锂一水合物（LiOH·H2O）、乙酰丙酮酸铜（Cu(acac)2）、N,N’-双(4-羟基-2,6-二甲基苯基)草酰胺（BHMPO）、对氰基苯甲酸均购自安耐吉公司，溴代丁酰亚胺（NBS）、三氯氧磷（POCl3）购自九鼎化学，苯甲酰氯、吡啶、哌啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇均购自天津科密欧公司，酯酶（E3019-3.5KU）购自西格玛奥德里奇。
1.2 实验方法与结果
1.2.1 9-N甲基咔唑（b）的制备 将咔唑（3.0
g，18
mmol）加入100
mL的三颈圆底烧瓶中，加入20
mL DMF溶解，冰浴搅拌下分批加入氢化钠（1.08
g，27
mmol），冰浴下反应30
min后，往反应液中滴加碘甲烷（2.56
g，18
mmol）室温反应l
h后，将反应液边搅拌边倒入80
mL水中，有白色固体析出，抽滤，减压干燥得9-N甲基咔唑（b）3.13
g，产率96%。1H-NMR
(400 MHz, DMSO) δ 8.15 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.59 (d, J=8.1 Hz, 2H),
7.47 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.21 (t, J=7.3 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H)。
1.2.2 3-醛基-9-N甲基咔唑（c）的制备
将化合物b（2.8
g，15
mmol）溶于DMF（12
mL）中，并加入100
mL的三颈圆底烧瓶中，冰浴搅拌下滴加三氯氧磷（6.9
g，45
mmol），后将反应瓶移至油浴锅中加热至100℃搅拌反应30
min，将反应液减压蒸去部分溶剂后，倒入25 mL冰水中搅拌，并用饱和氢氧化钠溶液调pH值至8，再用乙酸乙酯（3x25
mL）萃取3次后，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤三次，并用无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得化合物3-醛基-9-N甲基咔唑（c）的粗品，然后通过硅胶柱层析（石油醚：乙酸乙酯=10：1）分离纯化得白色固体2.73
g，产率87%。1H-NMR
(400 MHz, DMSO) δ10.07(s, 1H), 8.75(d, J=1.3Hz, 1H), 8.29 (d, J=7.8Hz,
1H), 8.01 (d, J=10.1 Hz, 1H), 7.97 (s, 3H), 7.75(d, J=8.6 Hz,
1H), 7.68(d, J=8.3 Hz, 1H), 7.60- 7.52 (m, 1H), 7.32(d, J=7.9 Hz,
1H), 3.94 (s, 3H)。
1.2.3
3-醛基-6-溴-9-N甲基咔唑（d）的制备 将化合物c（2.5
g，12
mmol）用DMF
（15
mL）溶解，并加入50
mL的三颈圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置水浴中，搅拌下加入NBS（2.14
g，12
mmol），室温下反应30
min，将反应液边加边搅拌倒入水中，抽滤得3-醛基6-溴-9-N甲基（d）的粗产物，乙醇重结晶得白色晶体3.11
g，产率：90%。1H-NMR
(400 MHz，
DMSO)δ 10.05 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.03 (d, J=8.6
Hz, 1H), 7.78 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.67 (s, 2H), 3.94 (s, 3H)。
1.2.4
3-醛基-6-羟基-9-N甲基咔唑（e）的制备 将化合物d（3 g，10.4 mmol）加入50 mL三颈瓶中，加入DMSO：H2O（4:1）10 mL，搅拌状态下分别加入LiOH·H2O（92 mg，21.8 mmol）、BHMPO（68 mg，0.2 mmol）、Cu(acac)2（45 mg，0.2 mmol），反应瓶用氮气置换三次后置80℃反应回流反应3 h，将反应液抽滤，滤液边加边搅拌倒入30 mL水中，析出黄色固体，抽滤，滤饼用甲醇打浆得黄色固体粉末1.72 g，产率：73.4%。1H-NMR
(400 MHz, DMSO) δ 10.02 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 7.94 (d, J=8.6 Hz, 1H),
7.66 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.60 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.49 (d, J=8.7
Hz, 1H), 7.06 (dd, J=8.7, 2.3 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H)。
1.2.5 化合物（f）的制备
将化合物e（1.7
g，7.5
mmol）加入50 mL三颈圆底烧瓶中，并用10
mL无水乙醇溶解，然后加入1,4-二甲基吡啶碘化物（1.86
g，8
mmol）和哌啶（0.32
g，3.7
mmol），回流反应5
h，减压蒸干溶剂，得红色固体，再经（DCM：MeOH=10:1）硅胶柱层析纯化得红色固体粉末2.92
g。产率：87.2%。1H-NMR
(400 MHz, DMSO) δ 8.84 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.23–8.14 (m, 4H), 7.97 (d, J=8.6
Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.67
(d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.29 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz,
1H), 4.25 (s, 3H), 3.90 (s, 3H)。
1.2.6 对氰基苯甲酰氯的制备
将对氰基苯甲酸（3
g，29.4
mmol）用二氯甲烷（20
mL）溶解，加入100
mL的三颈圆底烧瓶中，冰浴搅拌下缓慢滴加二氯亚砜（2.7
mL，51.0
mmol），然后将反应瓶移至油浴锅中，50℃下回流反应2
h，室温蒸去溶剂，得对氰基苯甲酰氯。
1.2.7 探针CzCN合成 将化合物f（2.9 g，6.5 mmol）加入50 mL三颈圆底烧瓶中，加入二氯甲烷（20 mL）和三乙胺（2.7 mL，19.7 mmol），冰浴搅拌状态下滴加对氰基苯甲酰氯（2.2 g，13.1 mmol），升温至50℃反应2 h，反应液减压蒸去溶剂，加入20 mL二氯甲烷溶解，用饱和食盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得红色固体粉末，用乙醇打浆得探针分子CzCN3.3g，产率 88.1%，1H
NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.81 (d, J=6.7 Hz, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.36 (d, J=8.5
Hz, 1H), 8.17 (dt, J=13.5, 9.1 Hz, 3H), 7.95 (dd, J=8.7, 1.2 Hz,
1H), 7.76 (dd, J=8.6, 7.1 Hz, 1H), 7.60–7.43 (m, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.97
(s, 1H)。
1.2.8 光谱实验 称取57.1mg探针分子CzCN溶于10 mL DMSO作为母液，再取100 μL母液加PBS缓冲溶液（PH=7.4）稀释至10 mL，最后用移液枪移取200 μL置2 mL的离心管中，加入800 μL的0.3mg.mL-1的羧酸酯酶PBS溶液，37℃孵育30min后用1 mL冰乙腈终止反应（底物终浓度为10 μmol·L-1，且DMSO 的含量为1%）。以1200 rpm的速度离心5 min后取上清液，利用紫外分光光度计扫描最大吸收波长（阴性对照组为未加入羧酸酯酶的PBS体系），同时以该最大吸收波长扫描最大发射波长，记录酶反应前后荧光强度。结果显示，探针分子在365 nm下呈现出强橙红色荧光，与酶反应后荧光淬灭（图2），经过全波长紫外扫描得到探针分子最大激发波长为420 nm，经酶处理后最大激发波长为423 nm。在420 nm激发波长下探针分子最大发射波长为580 nm，经酶处理后荧光发生淬灭，经计算探针分子斯托克斯位移为160 nm。同时对该探针分子进行三维荧光扫描（图3），将反应前后的发射波长与其所对应荧光值数据作曲线图，如图所示（图4），探针分子酶发生反应前后荧光强度发生显著变化。通过高效液相-质谱联用分别测定探针分子与酶发生反应前和反应后的质谱数据。结果显示（图5、6），与酶反应前探针分子的分子式为C29H22N3O2，[C29H22N3O2+H]+质荷比的计算值为444.1707，实测值为444.1717；与酶反应后产物的分子式为C21H19N2O，[C21H19N2O+H]+质荷比的计算值为315.1492，实测值为315.1511，证明羧酸酯酶水解了该探针的酯键，使其荧光淬灭。
图2 与酶反应前后的荧光变化
Fig.2 Fluorescence changes before and after
reaction with carboxylesterase
图3 探针分子CzCN的三维荧光图
Fig.3 Three-dimensional fluorescence of probe
molecule CzCN
图4 探针分子CzCN与酶反应前后荧光强度对比
Fig.4 Comparison of fluorescence intensity of
probe molecule CzCN before and after reaction with enzyme
图5 探针分子CzCN质谱图
Fig.5 Mass spectrograph of probe molecula
CzCN
图6 探针分子CzCN与酶反应后质谱图
Fig.6 Mass spectrograph of probe molecules CzCN
after reaction with carboxylesterase
2 总结与讨论
本文基于咔唑荧光团优异的光学性质和易于修饰、功能化的结构特点，选其作为荧光团，通过一系列化学反应构建了检测羧酸酯酶的荧光探针CzCN，我们利用了1H
NMR，HR-MS，对产物进行了表征，结果证明成功的合成了目标产物CzCN。通过光谱实验结果表明，羧酸酯酶可有效催化探针CzCN的羧酸酯键发生水解反应，且荧光强度在水解前后发生了显著变化，故可根据反应前后的荧光强度变化对羧酸酯酶进行检测与定量。
荧光探针发射波长小于500 nm时容易受到生物质背景荧光的干扰，限制其在生物体系的应用[22-23]，本研究合成的荧光探针CzCN具有较长的发射波长（580 nm）。可结合代谢表型试验与化学抑制试验，进一步检测荧光探针CzCN对羧酸酯酶的特异性，为荧光探针CzCN的深层次研究奠定基础。
参考文献
[1] Zhang Jun, Wang Dandan, Zou Liwei, et al. Rapid
bioluminescence assay for monitoring rat CES1 activity and its alteration by
traditional Chinese medicines[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2020,10(3):253-262.
[2] laizure S C, herring V, witbrodt K, et al. The role
of human carboxylesterases in drug metabolism: have we overlooked their
importance [J]. Pharmacotherapy, 2013,33:210-222.
[3] Imai T, Hosokawa M. Prodrug approach using
carboxylesterases activity: catalytic properties and gene regulation of
carboxylesterase in mammalian tissue[J]. Journal of Pesticide Science,
2010,35(3):229-239.
[4] Wang J, Williams E T, Bourgea J, et al.
Characterization of Recombinant Human Carboxylesterases: Fluorescein Diacetate
as a Probe Substrate for Human Carboxylesterase 2[J]. Drug Metabolism &
Disposition, 2011,39(8):1329-1333.
[5] Ross M K, Crow J A. Human carboxylesterases and their
role in xenobiotic and endobiotic metabolism[J]. Journal of Biochemical &
Molecular Toxicology, 2010,21(4):187-196.
[6] Zhang
Yangyang, Chen Wei, Feng Duan, et al. A spectroscopic off-on probe for simple
and sensitive detection of carboxylesterase activity and its application to
cell imaging.[J]. The Analyst,2012,137(3).
[7] Na K, Lee E Y, Lee H J, et al. Human plasma
carboxylesterase 1, a novel serologic biomarker candidate for hepatocellular
carcinoma[J]. Proteomics, 2010,9(16).
[8] Yamada S, Richardson K, Tang M, et al. Genetic
variation in carboxylesterase genes and susceptibility to isoniazid-induced
hepatotoxicity[J]. Pharmacogenomics Journal, 2010,10(6):524.
[9]温莹,景宁,阴彩霞.酯酶荧光探针的研究现状与进展[J/OL].大学化学:1-9[2022-05-18].
[10] Hatfield M J ,
Tsurkan L , Garrett M , et al.
Organ-specific carboxylesterase profiling identifies the small intestine and
kidney as major contributors of activation of the anticancer prodrug CPT-11[J].
Biochemical Pharmacology, 2011, 81(1):24-31.
[11] Sato Y, Miyashita A, Iwatsubo T, Usui T. Conclusive
identification of the oxybutynin-hydrolyzing enzyme in human liver.[J]. Drug
Metabolism & Disposition the Biological Fate of Chemicals, 2012, 40(5):902.
[12]
D D Wang, Jin Q , Hou J , et al. Highly sensitive and selective detection of
human carboxylesterase 1 activity by liquid chromatography with fluorescence
detection[J]. Journal of Chromatography B, 2016, 1008:212-218.
[13]王艳. 检测羧酸酯酶2的近红外双光子荧光探针及其在评估抗肿瘤药物中的应用[D].曲阜师范大学,2020.
[14] Liu H W, Chen L, Xu C, et al. Recent progresses
in small-molecule enzymatic fluorescent probes for cancer imaging[J]. Chemical
Society Reviews, 2018,47.
[15]
Wu J, Liu W, Ge J, et al. New sensing mechanisms for design of fluorescent
chemosensors emerging in recent years[J]. Cheminform, 2011,40(7):3483-3495.
[16] 别福升,任爱山,徐华琴,等.咔唑-N,S-杂冠醚类荧光探针的合成及其检测Ag~+性质[J].无机化学学报,2022,38(02):237-243.
[17] 余羿,何秀全.一种基于咔唑衍生物的用于检测细胞微环境pH的酸响应荧光探针[J].中国医疗器械信息,2021,27(10):30-33.
[18]
杨杨,陈晓彤,李鹏,等.咔唑-二氨基马来腈类荧光探针的合成及对Cu~(2+)和ClO~-的检测[J].分析试验室,2021,40(01):34-39.
[19]
王新茹,姜传坤,汪玉婷,等.咔唑基粘度荧光探针的合成、光学性能和细胞成像[J].合成化学,2020,28(11):977-982.
[20] 吴勇强.新型咔唑和1,8-萘酰亚胺类衍生物及其稀土配合物的合成与性能研究[D].湖南大学,2018.
[21] 王帅,孟燎,刘康,等.铀酰配位介导咔唑三羧酸超分子组装体的结构演变[, J].核化学与放射化学,2022,44(02):115-126.
[22] 刘爽,姜文硕,兰欣宇,等.过氧化氢荧光探针的研究进展[J].分析化学,2022,50(03):341-355.
[23]曹碧霞,韩正枝,刘荣.吡唑啉类荧光探针的设计与应用研究进展[J].化学试剂,2021,43(03):304-312.
基金项目：黔科合基础（ZK[2022]一般455）；黔科合基础（ZK[2022]一般489）；贵州中医药大学博士启动基金（[2021]19号）
作者简介：刘家芳（1995-），女，贵州毕节人，硕士研究生，主要研究方向为药物化学。
*通讯作者：柴慧芳（1977-），女，河北邯郸人，教授，主要研究方向为中药民族药药效物质基础研究。
订阅方式：
①在线订阅（推荐）：www.sdchem.net.cn
②邮局订阅：邮发代号24-109
投稿方式：
①在线投稿（推荐）：www.sdchem.net.cn
作者只需要简单注册获得用户名和密码后，就可随时进行投稿、查稿，全程跟踪稿件的发表过程，使您的论文发表更加方便、快捷、透明、高效。
②邮箱投稿：sdhgtg@163.com sdhg@sdchem.net
若“在线投稿”不成功，可使用邮箱投稿，投稿邮件主题：第一作者名字/稿件题目。
投稿时请注意以下事项：
①文前应有中英文“题目”、“作者姓名”、“单位”、“邮编”、“摘要”、“关键词”；
②作者简介包括：姓名、出生年、性别、民族、籍贯或出生地、工作单位、职务或职称、学位、研究方向；
③论文末应附“参考文献”，执行国标GB/T7714-2005标准，“参考文献”序号应与论文中出现的顺序相符；
④注明作者的联系方式，包括电话、E-mail、详细的通讯地址、邮编，以便联系并邮寄杂志。
欢迎投稿 答复快捷 发表迅速