紫外-可见分光光度法测定铁皮石斛多糖的含量-冉金凤-修改版

　　

紫外-可见分光光度法测定铁皮石斛多糖的含量

冉金凤¹，于海英¹，李启艳¹，张良雨¹，高樱¹，张金岭²，李俊婕^1*

（1.山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局化妆品原料质量控制重点实验室，山东 济南 250101；2.山东春旭化工设计有限公司，山东 济南 250014）

摘要：建立了一种采用紫外-可见分光光度法测定铁皮石斛多糖含量的方法。采用苯酚-硫酸法测定铁皮石斛多糖含量，考察了醇沉条件和煮沸时间对铁皮石斛多糖质量浓度的影响。结果表明，最佳醇沉和测定条件：醇沉浓度为体积分数80%乙醇，醇沉时间为16 h，煮沸时间为10 min。葡萄糖的质量在10.85～108.5 μg范围内，线性关系良好，相关系数（r）为0.9999。精密度、稳定性、重复性的RSD均小于2.0%，低、高浓度的平均加标回收率分别为98.3%和97.1%，RSD分别为0.86%和0.85%。该方法快速、简单、准确、可靠，可用于测定铁皮石斛多糖的含量，可以作为评价铁皮石斛药材的产品质量标准和为化妆品美妆功能研究提供科学依据。

关键词： 铁皮石斛多糖；紫外-可见分光光度法；醇沉条件；含量测定

Determination of Dendrobium Officinale Polysaccharide by Ultraviolet–visible Spectrophotometry

RAN Jinfeng¹, YU Haiying¹, LI Qiyan¹, ZHANG Liangyu¹, GAO Ying¹, ZHANG Jinling², LI Junjie^1*

(1. Shandong Institute for Food and Drug Control, NMPA Key Laboratory for Quality Control of Cosmetics Raw Material, Jinan 250101, Shandong, China;

2. Shandong Chunxu Chemical Engineering Design Co., Ltd., Jinan 250014, China)

Abstract: A Ultraviolet-visible spectrophotometry method was established to determine the polysaccharide content in Dendrobium officinale. The content of Dendrobium officinale polysaccharide was determined by phenol-sulfuric acid method. The effects of alcohol precipitation conditions and boiling time on Dendrobium officinale polysaccharide mass concentration were investigated. The results showed that the optimal alcohol settling and determination conditions were as follows: the alcohol settling concentration was 80% ethanol by volume fraction, the alcohol settling time was 16 h, and the boiling time was 10 min. Under this condition, there were good linear relationships between the mass and the absorbance value for glucose in the range of 10.85-108.5 μg, the correlation coefficient (r) was 0.9999. The relative standard deviation of precision, stability and repeatability were all less than 2.0%, the average recoveries of low and high concentrations were 98.3% and 97.1% while the relative standard deviation were 0.86% and 0.85%, respectively. This method is rapid, simple, accurate and reliable for the determination of Dendrobium officinale polysaccharide, which can be used as product quality standard to evaluate Dendrobium officinale and provide scientific basis for the study of cosmetic function.

Key words: Dendrobium officinale polysaccharide; Ultraviolet-visible spectrophotometry; alcohol precipitation condition; content determination

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属草本植物的干燥茎，是我国的传统名贵中药材之一，始载于《神农本草经》，书中记载铁皮石斛“除痹，下气，补五脏虚劳，羸瘦，强阴。久服厚肠胃，轻身延年”^[1]，《中华人民共和国药典》描述铁皮石斛具有“益胃生津、滋阴清热”^[2]的功效，铁皮石斛位列“中华九大仙草”之首，其神奇的药用价值备受人们推崇。铁皮石斛的化学成分主要包括黄酮类、多糖、氨基酸类、生物碱类、茋类、挥发油类化合物和微量元素等^[3-5]，其中，铁皮石斛多糖是主要活性成分，铁皮石斛多糖含量的高低是评判铁皮石斛品质的重要指标^[6-7]。多糖作为主要化学成分，具有延缓衰老、抗氧化、增强免疫力、改善糖尿病、调节肠道菌群、保肝、抑菌及抗白内障等药用功能^[8-13]。另外，在化妆品领域，《已使用化妆品原料名称目录（2015版）》也收录了铁皮石斛提取物 ^[14]，铁皮石斛多糖是一种常见的与皮肤亲合性好、无毒副作用的化妆品天然植物原料，具有嫩肤、保湿、抗皱、美白、强化皮肤屏障等多种功能^[15-19]。鉴于铁皮石斛多糖的药用价值和美妆功能，因此，本文采用紫外-可见分光光度法测定铁皮石斛茎提取物中的多糖含量，实验中采用体积分数80%乙醇溶液沉淀多糖，分离出水溶液中的单糖和低聚糖，采用苯酚-硫酸显色，显色强度与溶液中铁皮石斛多糖的浓度成正比，在488 nm波长下测定铁皮石斛多糖（以无水葡萄糖计)含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；Mettler Toledo MS型十万分之一电子天平（瑞士梅特勒公司）；TDZ5-WS型离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；HH-S8型恒温水浴锅（欧莱博有限公司）；Milli-Q型超纯水仪（美国Millipore公司）。

苯酚（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；硫酸（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；D-无水葡萄糖标准品（批号114k0034，纯度100%）：sigma-aldrich。

铁皮石斛茎提取物由无限极（中国）有限公司提供。2批样品批号分别为2021060801和2021042803。

1.2 标准系列溶液的制备

葡萄糖标准储备溶液：精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品1.0 g（精确至0.0001 g），置于100 mL容量瓶中，加超纯水溶解，定容，摇匀，得到质量浓度为10 mg/mL葡萄糖标准储备溶液，置4 ℃冰箱中保存。

葡萄糖标准溶液：精密量取10 mg/mL葡萄糖标准储备溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为100 μg/mL葡萄糖标准溶液。

标准系列溶液的配制：分别精密量取100 μg/mL葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL（相当于葡萄糖 0、10、20、40、60、80、100 μg)，置于25 mL具塞比色管中，各补加水至1.0 mL，精密加入1.0 mL 5%苯酚溶液，摇匀，再精密加5 mL浓硫酸，摇匀，密塞，置沸水浴中加热煮沸10 min，取出，在冰水浴中冷却至室温得待测溶液，在488 nm波长处采用紫外－可见分光光度法测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3 实验方法

1.3.1 铁皮石斛茎提取物的制备

工艺流程：铁皮石斛茎-清洗干净-烘干-粉碎机粉碎-80目筛过筛-加热回流水浴浸提-过滤-滤液-得铁皮石斛茎提取物。

操作步骤：取铁皮石斛茎，洗净后，于80 ℃干燥至恒重，研磨机粉碎后过80目筛，得铁皮石斛粉，称取适量铁皮石斛粉，置圆底烧瓶中，按照1:20的料液比加入超纯水，在70 ℃恒温水浴锅中加热回流浸提2 h，过滤，得提取液，再同法提取铁皮石斛滤渣2 次，合并3次提取滤液，得铁皮石斛茎提取物。

1.3.2 沉淀多糖

精密量取铁皮石斛茎提取物2 mL，置于15 mL离心管中，加入8 mL无水乙醇，摇匀，置4 ℃冰箱中冷藏过夜沉淀铁皮石斛多糖，取出后立即离心10 min（转速4000 r/min），弃去上清液，沉淀加8 mL体积分数80%乙醇洗涤2次，离心后弃去上清液，沉淀加热超纯水溶解，溶解后用超纯水转移至100 mL容量瓶中，冷却至室温后，加超纯水稀释定容至刻度，摇匀，得样品测定液。

1.3.3 样品测定

精密量取1 mL样品测定液，置于25 mL具塞比色管中，精密加入1.0 mL 5%苯酚溶液，摇匀，再精密加5 mL浓硫酸，摇匀，密塞，置沸水浴中加热煮沸10 min，取出，置冰水浴中冷却至室温，得待测溶液，在488 nm波长处测定吸光度。以标准曲线法得葡萄糖的质量，计算得样品中铁皮石斛多糖的含量。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

2.1.1醇沉浓度考察

精密量取铁皮石斛茎提取物4份，每份2 mL，加入无水乙醇和超纯水使含醇量体积分数分别达到 40%、60%、80%、90%，冷藏过夜沉淀多糖，离心10 min（转速4000 r/min），洗涤醇沉物，干燥后加热水溶解，冷却至室温后，用超纯水转移至100 mL容量瓶中，定容，摇匀，得待测溶液。然后按照“1.3.3样品测定”测定供试品溶液中铁皮石斛多糖质量，结果见图1。由图1可知，铁皮石斛多糖质量浓度随着醇沉浓度的提高而增加，达到90%时有所下降，因此选择乙醇体积分数80%作为醇沉浓度。

2.1.2醇沉时间的考察

精密量取铁皮石斛茎提取物6份，分别考察醇沉时间为2、4、8、16、22和24 h时对应的铁皮石斛多糖质量浓度，结果见图1。由图1所知，随着醇沉时间的增大，铁皮石斛多糖质量浓度逐渐增大，达到16 h后铁皮石斛多糖质量浓度开始减小，因此选择16 h作为醇沉时间。

2.1.3煮沸时间的考察

精密量取铁皮石斛茎提取物6份，分别考察煮沸时间为2、5、10、20 min时对应的铁皮石斛多糖质量浓度，结果见图1。由图1所知，随着煮沸时间的增大，铁皮石斛多糖质量浓度逐渐增大，达到10 min后不变，因此选择10 min作为煮沸时间。

图1 3种优化条件对铁皮石斛多糖质量浓度的影响

2.2 方法学验证

2.2.1线性关系考察试验

取葡萄糖标准系列溶液，在488 nm波长处采用紫外-可见分光光度法测定吸光度。测定结果表明葡萄糖的相关系数（r）为0.9999，葡萄糖的标准溶液在10.85～108.5 μg范围内线性关系良好，结果见表1。

2.2.2精密度试验

取配制的低浓度Std1（10.85 μg）和高浓度Std6（108.5 μg）标准溶液，在488 nm波长处连续测定6次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），由表1可知，低、高浓度精密度RSD分别为0.36%、0.06%，表明方法的精密度良好。

2.2.3重复性试验

精密量取混匀样品6份，平行制备6份样品测定溶液，结果见表1，统计6份样品重复性测定结果，铁皮石斛多糖质量浓度的重复性RSD为1.03%，说明该方法重复性良好。

2.2.4稳定性试验

取精密度项下标准溶液， 0、1、2、3、4、5 h在488 nm波长处测定吸光度。由表1可知，5 h内低、高浓度标准溶液的质量浓度RSD分别为1.67%、0.49%，表明铁皮石斛多糖的测定在5 h内稳定性良好。

表1 方法学结果

线性回归方程	相关系数（r）	线性范围/μg	重复性RSD/%	精密度RSD/%		稳定性RSD/%
				低浓度	高浓度	低浓度	高浓度
y=0.01051x+0.00986	0.9999	10.85～108.5	1.03	0.36	0.06	1.67	0.49

2.2.5加标回收率试验

精密量取混匀样品12份，分别制备低、高2个质量浓度的加标样品，每个添加水平测6个平行样，按实验方法制备样品测定液，在488 nm波长处进样分析测定，以标准曲线法定量，计算加标回收率，结果见表2。由表2可知，铁皮石斛多糖的低、高浓度平均加标回收率分别为98.3%和97.1%，RSD分别为0.86%和0.85%，表明该方法具有良好的加标回收率，方法准确度高。

表2加标回收率及相对标准偏差实验结果

组	原有量/ mg	加入量/ mg	测得质量/ （μg）	测得量/mg	平均加标回收率/ %	RSD/ %
低浓度 加标组	2.795	1.624	43.943	4.394	98.3	0.86
	2.785	1.624	43.842	4.384
	2.775	1.624	43.842	4.384
	2.775	1.624	43.842	4.384
	2.795	1.624	43.741	4.374
	2.795	1.624	43.741	4.374
高浓度 加标组	2.604	3.790	62.653	6.265	97.1	0.85
	2.614	3.790	62.552	6.255
	2.604	3.790	62.954	6.295
	2.604	3.790	62.954	6.295
	2.604	3.790	63.357	6.336
	2.614	3.790	62.854	6.285

2.2.6方法检出限试验

参照GB/T 5009.1-2003《食品卫生检验方法 理化部分 总则》中附录A.2.2规定，吸光法按国际理论与应用化学家联合（IUPAC）规定，检出限为3倍空白值的标准偏差相对应的质量（测定次数n≥20）。检出限公式为：检出限=k*SD/b，其中k－一般为3；SD－20次空白值的标准偏差；b－标准曲线斜率，/μg。结果见表3，由表3得铁皮石斛多糖的方法检出限为0.99 μg。

表3 检出限结果

实验次数	吸光度	实验次数	吸光度	标准偏差SD	3SD	斜率b	方法检出限/μg
1	0.001	11	0.008	0.003479	0.01044	0.01051	0.99
2	0.001	12	0.002
3	0.000	13	0.003
4	0.008	14	0.009
5	0.001	15	0.009
6	0.008	16	0.008
7	0.003	17	0.008
8	0.003	18	0.008
9	0.008	19	0.001
10	0.002	20	0.009

2.3 样品测定

为了验证方法的适用性，本文对2批铁皮石斛茎提取物样品进行了分析检测，精确量取2 mL铁皮石斛茎提取物，制备样品测定液，然后在488 nm波长处进行分析测定，以标准曲线法定量，计算铁皮石斛多糖含量（以无水葡萄糖计）。2批样品均检出铁皮石斛多糖，测定结果见表4。

表4 样品测定结果

测定项目	样品批号	铁皮石斛多糖质量浓度/（g·L-1）
铁皮石斛多糖	2021060801	2.81
	2021042803	3.20

3 结论

本文建立了紫外-可见分光光度法测定铁皮石斛多糖含量的方法，该方法线性关系为0.9999，方法检出限、精密度、重复性均良好，低、高浓度平均加标回收率分别为97.1%和98.3%，RSD分别为0.86%和0.85%，说明该方法准确可靠、稳定性好、灵敏度高、实用性强，可用于测定铁皮石斛多糖的含量，可以作为评价铁皮石斛药材的产品质量标准，同时可为化妆品天然植物原料铁皮石斛多糖的美妆功能研究提供科学依据。

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