基于发酵均质凝胶剂的VB12发酵培养基优化 发

　　

基于发酵均质凝胶剂的维生素B12发酵培养基优化

高承斌^1.2，张建民^1.2，刘春风^1.2，王光明^1.2，李海涛¹，温艳云¹

1.河北华北制药华恒药业有限公司，2.河北省维生素技术创新中心

摘要

本文对本项目组已取得专利的发酵均质凝胶剂的前期发现及优化过程进行了较为详尽的阐述，为解决维生素B12发酵过程中培养基消毒过程中大面积结皮、菌体前期生长缓慢和后期氮源缺失导致发酵提早终止问题，基于之前多品种发酵经验及相关资料查询筛选出淀粉、氯化铁和黄原胶作为添加剂，并通过单因素实验和响应面优化法对其配比进行优化，极大改善了上述问题，并成功将单位提高26.84%，提升了维生素B12发酵指数。

关键词 发酵均质凝胶剂;维生素B12;响应曲面;优化

Abstract

This paper gives a detailed description of the preliminary discovery and optimization process of the patented fermentation-homogeneous-gel of the project team. In order to solve the problems of large area of crust during medium disinfection, slow growth of bacteria in early stage and lack of nitrogen source at late stage leads to premature termination of fermentation during the process of 维生素B12 fermentation, Starch, ferric chloride and xanthan gum were selected as additives based on the previous multi-variety fermentation experience and relevant data query. The ratio of starch, ferric chloride and xanthan gum was optimized by single factor experiment and response surface optimization method, which greatly improved the above problems, and successfully increased the unit by 26.84%, and improved the 维生素B12 fermentation index.

Key word：Fermentation-homogenous-gel;VB12;Response surface;optimize.

维生素B12为钴胺素类化合物是目前已知分子量最大的维生素^[1]，参与制造骨髓红细胞，人体缺乏会造成恶性贫血^[2]，引起心脏病、神经紊乱以及癌症等疾病^[3]。维生素B12还用于神经系统疾病如神经炎、神经萎缩的治疗等^[4]，亦可与叶酸合用用于治疗各种巨幼红细胞性贫血、抗叶酸药引起的贫血及脂肪泻，广泛应用于医药和食品工业^[5]。

高等动植物不能制造维生素B12，早期人类主要通过从海产品以及某动物内脏中摄取维生素B12^[6]。目前国内外商品化的维生素B12几乎都是通过微生物发酵进行生产的^[7-8]。但是微生物发酵生产维生素B12目前存在以下缺陷：1）维生素B12发酵培养基普遍采用的底料为玉米浆，该发酵培养基在消毒过程中蛋白质变性产生大面积结皮，若清理不当，再经高温碳化就容易形成消毒死角导致生产过程中发生染菌，并且因蛋白变性结皮导致培养基中氮源水平降低，导致发酵指数较低。2）目前的发酵培养基在发酵生产维生素B12的过程中，菌体前期生长缓慢，影响维生素B12的合成。3）发酵培养基消毒后，速效磷源和氮源以游离的形式存在，在发酵前期迅速被利用，导致发酵后期磷、氮源缺失，进而导致发酵提早终止，影响维生素B12的产量。

针对现有维生素B12发酵生产过程中存在的上述问题，本文通过对维生素B12发酵培养基中显著因子进行筛选，筛选出淀粉、氯化铁和黄原胶3个显著影响因子，并利用单因素试验确定了边界值，之后使用响应面分析法，对个因素进行优化，以提高了维生素B12发酵，为后续工业化扩大生产及相关专利申请奠定理论基础。

1.实验材料与方法

1.1菌种

黏着剑菌（146A066），河北华北制药华恒药业有限公司保藏。

1.2仪器与设备

智能全温空气振荡器（美壁MQZ-910）、高压液相色谱仪（Agilent-1260 Infinity II）、分光光度计（T6新悦）、梅特勒电子天平（METTLER TOLEDO AG204）、磁力搅拌器 （EMS-4A）、离心机（SIGMA3-18K）、粘度计（上海轩澄NDJ-8s）、显微镜（尼康801）。

1.3基础培养基

每升培养基中含：玉米浆55-70g，氧化镁0.4-0.6g，甘油1.8-4.8g，七水合硫酸镁1-1.5g，硫酸铵0.8-1.2g，尿素0.4-0.6g，磷酸氢二铵0.5-1g，磷酸二氢钾0.5-1g，硫酸锌0.05-0.1g，碳酸钙1.7-1.8g，液糖40-50g，甜菜碱6-10g，七水合氯化钴0.02-0.04g，5,6二甲基苯丙咪唑0.02-0.04g和消沫剂0.2-0.25g。

1.4培养条件

摇瓶发酵培养：取OD大于0.22且无菌状况良好的液体菌种, 接入各组试验培养基中（接种量10 %）, 智能全温空气振荡器、32 ℃、150 r /min 振荡培养7 d 。

放大发酵培养：发酵罐培养基接种前调pH 至6. 5 , 压力0. 5 ×105 Pa , 在温度为29-31℃、起始通气量为0.35-0.45m3／m3·min的搅拌条件下，将菌种接种到发酵培养基中进行发酵培养，当发酵液中的溶氧DO值≤20%时，通气量提升28-32%，保持通气至完成发酵过程。

2方法与结果

2.1均质凝胶剂原料筛选

对于发酵消毒过程中蛋白质变性产生大面积结皮现象，本项目组通过之前四环素发酵灭菌相关经验，认为适量加入淀粉可基本消除该现象，于是基于四环素发酵过程中淀粉与玉米浆3.25/1的比例为中心，进行摇瓶比例摸索试验。因结皮属于直观视觉感受，为将该问题转化为具体的实验数据，我们通过对消毒后摇瓶培养基进行3层纱布过滤的方式，将过滤后纱布上残留固形物进行称重来侧面反应结皮现象严重与否，无肉眼可见固形物为解决结皮显现标准，粘度采用粘度计测量，以对照培养基粘度为0点进行相对粘度对比。试验结果如图1所示，通过试验发现淀粉与玉米浆比例大于0.01/1即可消除结皮现象，但当比例大于0.1/1时，因为没有糖化酶加入，反而使培养基粘度呈指数增长，反而不利于消毒质量提高。最终初步将淀粉加入量定为玉米浆加量的1~10%。

图 1淀粉单因素试验

Fig.1 Single factor test of starch

图 2 氯化铁单因素试验

Fig.2 Single factor test of ferric chloride

图 3 黄原胶单因素试验

Fig.3 Single factor test of xanthan gum

通过对相关提高菌体发酵生物量（维生素B12生物量行业代称OD值测量方法：分光光度计测量700nm吸光值，以蒸馏水为0点，发酵液稀释100后测量，之后乘以100的稀释倍数得到数值，图表中以OD值代称）论文资料^[9-11]查询及分析，项目组锁定了黄原胶及氯化铁作为生物量提高的辅助剂，并以论文中最优添加量（黄原胶0.08g/L氯化铁0.1g/L）为中心进行比例摇瓶摸索试验。通过试验发现1）如图2所示，维生素B12发酵添加氯化铁低于0.3g/L均可提高生物量，在0.3-0.45g/L对生物量提升无明显作用，当高于0.45g/L后会有明显抑制作用；2）如图3所示，维生素B12发酵添加黄原胶低于0.03g/L或在0.07-0.08g/L时，对生物量提升无明显作用，在0.03-0.07g/L时可提高生物量，当高于0.08g/L后会有明显抑制作用，当高于0.12g/L后会出现明显块状物，导致消毒质量急速下降，图3中最后一点OD值异常升高就是因为该实验组3个摇瓶均出现杂菌所致。

综合上述单因素试验结果，本项目组初步确定了淀粉、黄原胶及氯化铁作为凝胶均质剂主要组分，并确定了各个组分的边界值。

2.2小试配方分组及试验结果

基于Design-Expert12软件进行了3因素相应试验方案设计及考察，淀粉、黄原胶及氯化铁采用上述试验边界值进行方案设计，并按方案总共20组摇瓶每组进行3批次试验，每批次4个平行瓶，之后去掉明显异常试验个体计算平均值得出试验结果，方案和结果如表1所示：

表 1响应曲面试验结果

Tab.1 Response surface test results

使用Design expert12软件对数据进行分析，得到的编码方程为Y （维生素B12发酵单位）= 246.412 +0.75*A+1.275*B-0.175*C+0.4*AB+0.45*AC-0.3*BC-10.38125*A2-2.63125*B2-2.431*C2，Y （氨氮）= 114.1375 +0.4875*A-1.4125*B+0.1*C+0.25*AB-0.075*AC-2.625*BC+1.75625*A2+1.85625*B2+0.38125*C2。得到相应曲面如图1图2所示。之后运用软件进行预测，得到淀粉0.5945g/L氯化铁0.2890g/L黄原胶0.050g/L时可取得最佳单位240.759mg/L最佳氨氮114.585mg/100ml。

图 4以发酵单位为相应条件

Fig.4 Take fermentation unit as corresponding condition

图 5以氨氮值为相应条件

Fig.5 Take ammonia nitrogen value as corresponding condition

为验证软件预测的准确性和模型与现实摇瓶的契合度，以淀粉0.59g/L氯化铁0.29g/L黄原胶0.05g/L配比进行3批摇瓶验证试验，得到平均单位241mg/L平均氨氮115mg/100ml，与软件预测值符合率良好，且单位提高26.84%，显著提高了摇瓶维生素B12的产量并避免了玉米浆引起的大面积结皮现象。

3结论

针对维生素B12发酵培养基消毒过程中大面积结皮、菌体前期生长缓慢和后期氮源缺失导致发酵提早终止现象。本课题组基于之前多品种发酵经验及相关资料查询，筛选出上述现象的中显著影响因子——淀粉、氯化铁和黄原胶，并利用单因素试验确定了边界值 ，之后结合Design-Expert软件进行方案设计及数据分析，利用响应曲面法成功将摇瓶平均单位由190mg/L提高到241mg/L，将单位提高26.84%，进一步提升了维生素B12发酵指数，基本消除微生物发酵液中的蛋白结皮现象，减少培养基中的消毒死角，降低大面积蛋白变性，提高蛋白利用率和消毒质量。并将淀粉、氯化铁和黄原胶优化配比进行专利申请，目前已取得《一种发酵凝胶均质剂及其制备方法和应用》的发明专利授权，专利号：ZL 2020 1 1375783.3。

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