黄燕-UPLC-MSMS法测定饲料中万古霉素与去甲万古霉素-山东化工 - （新）

　　

UPLC-MS/MS法测定饲料中万古霉素与去甲万古霉素 黄燕 (福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量检验检测中心（福州），福建 福州 350000) 摘要：基于超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），建立了饲料中万古霉素和去甲万古霉素2种糖肽类抗生素的测定方法。样品经0.1%甲酸水-乙腈提取，MCX固相萃取柱净化，UPLC-MS/MS进行分析。方法学验证表明，万古霉素和去甲万古霉素在10 ng/mL~1000 ng/mL范围内线性关系较好（R＞0.999），定量限分别为50.3 μg/kg、54.7 μg/kg；在100 μg/kg、200 μg/kg和1000 μg/kg加标水平下，平均回收率在79.3% ~ 108.6%之间，相对标准偏差RSD在1.9 %~ 9.8%（n=6）。该方法定量限低、精密度好，可应用于饲料中万古霉素和去甲万古霉素的定量分析。 关键词：万古霉素；去甲万古霉素；饲料；糖肽类抗生素；UPLC-MS/MS [中图分类号]TQ [文献标识码]A [文章编号] [收稿日期] [基金项目] 福建省产品质量检验研究院科研项目（No：KY202115A） [作者简介] 黄燕，女，硕士研究生，中级工程师，主要研究方向：食品质量与安全。 Determination of Vancomycin and Norvancomycin in Animal Feed by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Huang Yan （Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, China National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food（Fuzhou）,Fujian, Fuzhou 350000, China） Abstract：A method for determination of vancomycin and norvancomycin in animal feed was established by ultra-high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The samples were extracted by 0.1% formic acid - acetonitrile and were purified on a MCX solid - phase extraction column. The samples were analyzed by UPLC-MS/MS. Methodological validation shows that good linearity（r > 0.999） were observed in the range 10 ng/mL~ 1000 ng/mL for vancomycin and norvancomycin，the limit of quantitations were 50.3 μg/kg, 54.7 μg/kg.The recoveries ranged between 79.3% and 108.6% at three spiked (100、200、1000 μg/kg) with relative standard deviations ( n = 6) between 1.9% and 9.8 %. This method showed lower limit of quantification, good precision, and was suitable for the quantitative analysis of vancomycin and norvancomycin in animal feed. Keyword：vancomycin；norvancomycin；animal feed；glycopeptide antibiotics；ultrahigh performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry 引言 万古霉素(vancomycin)和去甲万古霉素(norvancomycin)是由东方链霉菌代谢产生的三环糖肽类抗生素，其结构如图1所示[1]。两者具有相似的药理性质，均为通过阻断革兰氏阳性菌的细胞壁合成而达到治疗细菌感染的目的，是目前人类应对超级细菌的“最后一道防线”。然而由于抗生素类药物的不合理使用，出现了具有致死性的耐万古毒素菌(MRSA)和万古霉素抗药性肠球菌（VRE），极大的威胁了人类的生命安全[2]。虽然我国农业部第560号公告已将万古霉素规定为禁用兽药，但还是有不法分子在饲料中添加万古霉素和去甲万古霉素抗生素，以达到促进牲畜生长和预防疾病等目的，这无疑将加速耐药细菌的发展。当前农业部1862号公告-3-2012《饲料中万古霉素的测定液相色谱-串联质谱法》仅适用于万古霉素的测定，并未建立饲料中去甲万古霉素的检测方法。因而建立饲料中万古霉素及去甲万古霉素同时测定的方法是非常必要的。 目前关于万古霉素和去甲万古霉素的检测方法主要有荧光免疫法[3]、化学发光免疫法[4]、毛细管电泳化学发光法[5]、近红外光谱法[6]、色谱法及其联用技术[7-10]等，检测对象主要为血液样品及动物源性食品，对于饲料基质的前处理方法少有提及。本研究基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）建立了饲料中万古霉素和去甲万古霉素的测定方法，该方法具有灵敏度高、重现性好、准确度高等优点，可满足饲料检测的要求。 图1 万古霉素和去甲万古霉素的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of vancomycin and norvancomycin 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 万古霉素盐酸盐标准品(CAS号1404-93-9，纯度99.0%，阿尔塔科技)、去甲万古霉素盐酸盐标准品(CAS号213997-73-0，纯度87.7%，阿尔塔科技)；Waters ACQUITY UPLC 系列：BEH C18色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm）、BEH C8色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm）、HSS T3色谱柱（2.1×150 mm，1.7 μm）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；0.22 μm PTFE滤膜（D&B）；MCX柱、C18柱、PEP柱（Agela Technologies，规格均为500 mg/6 mL）。 超高效液相色谱LC-30AD、三重四级杆-串联质谱仪8050（均为日本岛津公司）；电子分析天平（BT 224 S，德国赛多利斯公司）；超声波振荡器（DS-8510 DTH，上海生析超声仪器有限公司）；旋涡混均器（MS 3 basic，IKA公司）；高速冷冻离心机（Aanti J-E，美国Beckman Coulter公司）；超纯水纯化系统（Milli-Q，美国Millipore公司）。 1.2 仪器条件 1.2.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1×150 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：5.0 μL；流速：0.3 mL/ min；流动相A：0.2%甲酸水溶液，流动相B：乙腈溶液，梯度洗脱。条件：0~0.50 min，5% B；0.51~3.50 min，5%~30% B；3.51~5.50 min，90% B；5.51~7.00 min，90% B；7.01~9.00 min，5% B；。 1.2.2 质谱条件 离子源为ESI正离子源，多反应监测（MRM）模式；接口温度：250oC； DL温度：250oC；雾化气流量：3.00 L/min；干燥气流量：6.00 L/min；加热块温度：400 oC；加热气流量：10.00 L/min；万古霉素、去甲万古霉素的定量、定性离子及质谱分析参数（详见表1）。 表1 质谱参数 Table1 Mass spectrometric parameters 化合物名称 分子量 母离子/ ( m/z ) 子离子/ ( m/z ) Q1 Pre偏差/ ( V ) 碰撞能量/ ( V ) Q3 Pre偏差/ ( V ) 万古霉素 1449 725.0 100.1* -20 -37 -20 725.0 1306.3 -20 -17 -30 去甲万古霉素 1435 718.0 100.1* -20 -26 -10 718.0 1292.3 -24 -14 -40 注：*为定量离子 1.3 标准溶液的配制 分别准确称取适量万古霉素和去甲万古霉素标准品，0.1%甲酸水配成100 mg /L的标准储备液，4℃冷藏冰箱储存。分别吸取1.00 mL储备液于10 mL容量瓶中，0.1%甲酸水定容得到10 mg /L的标准中间液，4℃冷藏冰箱储存。 空白饲料基质经提取和净化后的样液制备混合标准校正曲线，外标法定量。 1.4 样品前处理 称取样品1 g（精确至0.001 g）于50 mL具盖塑料离心管中，加入5 mL 0.1%甲酸水-乙腈（80:20，体积比）提取液，涡旋5 min，超声10 min，高速离心取出上清液，再加入5 mL提取液重复提取一次。合并提取液过MCX柱（500 mg，6 mL，使用前用5 mL甲醇、5 mL 0.1%甲酸水活化），5 mL水和5 mL甲醇淋洗，5 mL 10%氨水甲醇洗脱。洗脱液40 ℃氮吹浓缩至近干，10%乙腈水（含0.2%甲酸）复溶至2.00 mL，过0.22 μm PTEF滤膜后上机测试。 2 结果与分析 2.1质谱条件的优化 万古霉素及去甲万古霉素是由多个氨基酸和糖缩合而成的弱碱性糖肽类抗生素，极性较强，适用于电喷雾离子源（ESI）分析[8]。实验发现采用正离子模式全扫描时，万古霉素和去甲万古霉素易形成[M+H]2+母离子峰，而负离子模式全扫描时未发现相关离子。随后采用产物离子扫描模式寻找相应的碎片离子（见图2）。通过仪器自带的优化软件，获得最优的Q1 Pre偏差、碰撞能量、Q3 Pre偏差等关键参数。最终选取丰度较高的2个子离子分别作为定量和定性离子（具体信息见表1）。 图2 万古霉素和去甲万古霉素产物离子扫描质谱图 Fig 2 Product ion scanning mass spectrum of vancomycin and norvancomycin 2.2 液相条件的优化 2.2.1色谱柱的选择 多数研究采用反相色谱柱进行色谱分离[7]、[11]，本实验对比了Waters ACQUITY UPLC系列中 BEH C18色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm）、BEH C8色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm）、HSS T3色谱柱（2.1×150 mm，1.7 μm）三种类型色谱柱的分离效果。结果显示HSS T3在保留能力、峰型、峰高均优于C18柱和C8柱。万古霉素和去甲万古霉素极性较强，两者结构仅相差1个甲基，虽然较难实现完全分离，但利用UPLC-MS/MS测定，并不影响其准确定性和定量分析。因此选择Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱作为本试验的色谱柱。目标物混合标准溶液(500 ng /mL)的提取离子色谱图见图3。 图3 万古霉素和去甲万古霉素的提取离子色谱图(500 ng / mL) Fig. 3 Extracted ion chromatogram of norvancomycin and vancomycin (500 ng /mL) 2.2.2流动相的选择 目标物结构中带有较多氨基和羧基，在采用电喷雾正离子模式分析时加入适量挥发性酸可有效促进离子化，提高灵敏度[11]。实验对比0.1 %甲酸水/乙腈、0.2 %甲酸水/乙腈、0.3 %甲酸水/乙腈，结果显示，当流动相中甲酸水浓度为0.2%时，两者峰面积响应最高。因此，本试验选择0.2 %甲酸水/乙腈作为流动相。 2.3前处理条件的优化 2.3.1提取溶剂的选择 基于万古霉素和去甲万古霉素易溶于水，微溶于乙腈等有机溶剂，且在酸性条件下稳定等性质[8]，本实验通过在空白饲料基质中添加100 μg/kg的混合标准溶液，对比0.1%甲酸水、0.1 mol/L HCl、0.05 mol/L磷酸缓冲盐（pH 3.2）作为单一提取溶剂的提取效果。确定提取液为0.1%甲酸水时回收率最高。为了能更好地沉淀蛋白，分别向0.1%甲酸水中加入10%、15%、20%、30%、50%乙腈。实验结果显示随着乙腈比例的升高，提取效率略有下降。但适当加入乙腈可沉淀部分蛋白，使提取液更加澄清，有利于后期SPE柱净化。最终确定0.1%甲酸水-乙腈（80:20）为提取液。 实验通过在阴性饲料中的加标实验（100 μg/kg），对比5 mL提取液提取一次、10 mL分两次提取，15 mL分三次提取、20 mL分四次提取的方式进一步确定提取液体积和次数。结果显示，5 mL提取液提取一次时万古霉素和去甲万古霉素的回收率分别为52.1%、54.9%；10 mL提取液分两次提取时，回收率分别达到84.3%、86.7%；而超过两次提取后回收率并无明显提高。综合考虑后续过柱时间，最终选择采用10 mL提取液分两次提取。 2.3.2净化方式的选择 实验比较了3种不同的固相萃取柱MCX柱、C18柱、PEP柱（Agela Technologies，规格均为500 mg/6 mL）在100 μg/kg的加标水平下的净化效果。其中MCX柱按照1.4净化，C18柱、PEP柱（5 mL甲醇、5 mL水活化）上样后采用5 mL水淋洗，5 mL甲醇洗脱。 结果如表2所示，MCX柱对万古霉素和去甲万古霉素的净化效果明显优于C18柱和PEP柱。系因提取液0.1%甲酸水-乙腈（80：20）有机相比例较高，导致极性较强的万古霉素和去甲万古霉素在上样阶段穿透C18柱和PEP柱。而MCX柱在酸性条件下对碱性的万古霉素和去甲万古霉素的保留较强，转化为碱性环境时才解析出万古霉素和去甲万古霉素，所以回收率高于C18柱和PEP柱。最终选择MCX固相萃取柱净化饲料。 表 2 净化方法的选择 Table 2 Selection of purification method MCX柱 C18柱 HLB柱 万古霉素 86.1% 29.7% 48.2% 去甲万古霉素 90.4% 27.5% 46.3% 2.4 方法学验证 2.4.1样品基质效应 选取空白配合饲料和浓缩饲料基质，按照1.4进行前处理后用100 ng/mL的混合标准溶液复溶，其峰面积Amatrix与100 ng/mL的纯溶剂标准混合溶液的峰面积Asolvent的比值评价基质效应ME%。ME%=(Amatrix/Asolvent)×100%，当ME%＞100%为基质增强，ME%＜100%为基质抑制。配合饲料的万古霉素和去甲万古霉素基质效应ME%分别为85.7%、83.2%、浓缩饲料分别为78.1%、75.6%，均存在不同程度的基质抑制，因而采用基质匹配标准曲线校正。 2.4.2线性范围、检出限和定量限 取基质混合标准工作溶液进行测定，以标准工作液浓度（ng/mL）为X轴，各组分峰面积为Y轴计算线性回归方程。结果列于表3，万古霉素和去甲万古霉素线性关系较好，相关系数（r）均在0.999以上。空白基质样品加标100 μg/kg，用其测出的信号与基线噪声进行比较。当信噪比S/N=10所测得的浓度即为定量限（LOQ，S/N=10）。万古霉素和去甲万古霉素的检出限分别为15.1 μg/kg、16.4 μg/kg定量限分别为50.3 μg/kg、54.7 μg/kg。其中万古霉素的检出限和定量限均低于农业部1862号公告-3-2012《饲料中万古霉素的测定液相色谱-串联质谱法》。 表3 线性关系、检出限和定量限 Table 3 Regression equations，detection limits and quantitative limits 名称 线性范围/（ng/mL） 线性回归方程 相关系数r 检出限 / μg/kg 定量限 / μg/kg 万古霉素 10-1000 y=4121.21*x+6152.91 0.99963 15.1 50.3 去甲万古霉素 10-1000 y=4165.05*x+6726.20 0.99967 16.4 54.7 2.4.3准确度与精密度 分别以阴性配合饲料和浓缩饲料为基质，进行添加水平为100 μg/kg、200 μg/kg、1000 μg/kg的加标回收实验，各加标水平平行试验6次。结果如表4所示，平均回收率79.3% ~ 108.6%，相对标准偏差RSD1.9 %~ 9.8%，表明使用该方法检测饲料中的万古霉素和去甲万古霉重现性好，符合GB/T 27404-2008的分析要求。 表4 万古霉素和去甲万古霉素的准确度、精密度和回收率 Table 4 Accuracy, precision, recovery of vancomycin and norvancomycin 化合物 加标水平 /（μg/kg） 配合饲料 浓缩饲料 回收率 / % RSD / % 回收率 / % RSD / % 万古霉素 100 81.2 9.3 89.6 9.7 200 84.3 5.4 83.4 4.9 1000 92.1 2.5 101.9 3.5 去甲万古霉素 100 79.3 8.8 82.9 9.8 200 85.1 4.7 95.3 4.3 1000 105.9 1.9 108.6 2.4 2.5 实际样品测定 利用本方法对15份配合饲料和15份浓缩饲料进行万古霉素和去甲万古霉素的测定，结果均检出。虽然实际样品未检出阳性样品，但加标回收实验的回收率和精密度证明本方法准确可靠。 3 结 论 本文采用UPLC-MS-MS法，结合MCX固相萃取净化技术，建立了饲料中万古霉素和去甲万古霉素的同时测定方法，并对相关条件进行优化。该方法定量限低、重现性好，为相关部门监测饲料中的万古霉和去甲万古霉素等糖肽类抗生素的添加水平提供技术支持。 参考文献 [1]Min Liu 1，ZhiHui Yang，GuoHui Li．A novel method for the determination of vancomycin in serum by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application in patients with diabetic foot Infections［J］．Molecules，2018，23，2939 [2]周珊，刘家云，徐修礼等．万古霉素耐药肠球菌分子流行病学及耐药性分析［J］．中国临床药理学杂志．2020，36（19）：3099-3102 [3]Chongxin Xu，Qi Hana，Sa Dong，et al．Establishment of an ultrasensitive indirect competitive time-resolved fluoroimmunoassay for vancomycin determination［J］．Food and Agriculture Immunology，2019，30 (1)：862-877 [4]邹国芳，钱文璟，李巍．高效液相色谱法和荧光偏振免疫法测定万古霉素血清浓度的比较［J］．中国医院药学杂志．2015，35（01）：68-71 [5]李享，王玮，檀笑昕等．毛细管电泳化学发光法测定人血清中的万古霉素和去甲万古霉素［J］．分析试验室，2017，36（2）：138-142 [6]赵洁，臧恒昌，姜笃银．近红外光谱分析技术用于血浆中万古霉素浓度检测的可行性研究药物生物技术［J］．2016，23（06）：503-507 [7]薛婷婷，黄冬梅，娄晓祎等．双固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定鱼类中糖肽类抗生素残留量［J］．分析试验室，2018，37（01）：36-39 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