王世光`，曾军杰*
（浙江海洋大学海洋与渔业研究所,浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021）
摘 要: 河豚毒素是自然界中所发现毒性最大的神经毒素之一，作为钠离子通道阻断剂主要麻痹肌肉与神经。鉴于对河豚毒素在医疗领域现有的认知，通过探讨河豚毒素的性质结构、原料来源、提取、分离及检测方法等方面的因素,旨在建立一种高效制备高纯河豚毒素的新工艺，从而加强高纯河豚毒素制品在局部麻醉、癌症晚期镇痛、戒毒等方面的应用。在解决毒性、注射有效剂量、安全剂量及给药方法等一系列难题上，高纯度河豚毒素有利于确保药品的稳定，提高药用的安全性。
关键词：河豚毒素；结构；提取；分离；检测；应用
中图分类号：R996.3 文献标识码: A
A Review of The Study of tetrodotoxin
WANG Shi-guang, ZENG Jun-jie*
(Marine and Fishery Institute
of Zhejiang Ocean University, Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang
Province, Zhoushan 316021, China )
Abstract: Tetrodotoxin is one of the
most toxic neurotoxins found in nature.It is distributed in liver, ovary, skin,
blood and muscle in puffer fish, and their content varies with different
seasons.we discuss the structure, source, extraction, separation and detection
methods of tetrodotoxin for obtaining high purity tetrodotoxin, in order to
strengthen the application of high purity tetrodotoxin products in local
anesthesia, late cancer analgesia and detoxification.High purity tetrodotoxin
is benefit for improving stability and safety of medicine in solving a series
of problems such as toxicity, effective dose, safe dose and drug delivery.
Key Word: tetrodotoxin
;structure;extraction;separation;detection;application
1研究背景
1.1河豚鱼资源概况
河豚一般指硬骨鱼纲的鱼类，经常在长江口岸活动，江浙百姓都习惯称呼它为
“河豚鱼”。目前，已经发现的河豚鱼种类就已高达数百种之多，常见的河豚鱼也有几十种，而无毒的种类较少，仅为20种左右。在我国发现的河豚鱼有40多种，分8个属，从45°N到45°S都有分布，我国主要分布于长江下游一带和沿海地区[1-2]，主要品种及毒力分布见表1。当河豚鱼发现异常状况时，通常体内会产生TTX来躲避敌人带来的威胁。河豚鱼的美味由来已久，然而食用者发生死亡的例子也时有发生[3]，所以在中国，从1998年开始就已经禁止食用的，甚至在东南亚的一些国家都颁布法令，禁止河豚鱼在市场上流通，我国民间也因此有了“拼死吃河豚”的说法。2016以来，农业农村部逐渐开放河豚鱼养殖，辽宁、江苏、广东等共16家企业为养殖试验点，品种为红鳍东方鲀和暗纹东方鲀。
表1 我国常见河豚鱼品种、分布海域及各器官毒力情况
Tab.1 Species, distribution sea area and toxicity of
various organs of common puffer fish in China
|
品种 |
分布海域 |
毒力器官 |
|||
|
肝脏 |
性腺 |
皮肤 |
肌肉 |
||
|
红鳍东方鲀 |
黄海、渤海、东海 |
B |
B |
B |
D |
|
双斑东方鲀 |
黄海、渤海、东海 |
C |
C |
C |
D |
|
黄鳍东方豚 |
黄海、渤海、东海、南海 |
B |
B |
D |
D |
|
假睛东方豚 |
黄海、渤海、东海 |
C |
C |
D |
D |
|
虫纹东方豚 |
黄海、渤海、东海 |
B |
B |
C |
C |
|
菊黄东方豚 |
黄海、渤海、东海 |
C |
B |
B |
C |
|
暗纹东方豚 |
东海 |
C |
C |
C |
D |
|
紫色东方豚 |
东海 |
A |
A |
B |
D |
|
铅点东方豚 |
南海 |
C |
C |
C |
D |
|
横纹东方豚 |
东海、南海 |
C |
C |
D |
D |
|
墨绿东方豚 |
南海 |
C |
D |
D |
D |
|
星点东方鲀 |
东海 |
A |
A |
B |
C |
|
斑点东方鲀 |
东海 |
A |
A |
B |
C |
|
豹纹东方鲀 |
黄海、渤海 |
A |
A |
B |
D |
|
密点东方鲀 |
黄海、东海 |
B |
B |
D |
D |
|
棕斑兔头鲀 |
黄海、东海、南海 |
D |
D |
D |
D |
|
密沟鲀 |
东海、南海 |
D |
D |
D |
D |
|
水纹扁背鲀 |
东海 |
B |
C |
D |
D |
|
六斑刺鲀 |
黄海、东海、南海 |
D |
D |
D |
D |
|
斑鳍短刺鲀 |
东海 |
D |
D |
D |
D |
|
粒突箱鲀 |
东海 |
D |
D |
D |
D |
注：A为剧毒：毒性>1000Mu/g;B为强毒：100Mu/g<毒性<1000Mu/g;C为弱毒：10Mu/g<毒性<100Mu/g;D为无毒：毒性<10Mu/g
1.2河豚毒素介绍
河豚毒素（Tetrodotoxin，简称TTX）是生物体内所含比较常见的生物碱。它是毒性极强的神经毒素，毒力约为氰化物的1250倍。对于TTX的来源众说纷纭，既有认为TTX是外源性的，也有认为是内源性的，至今都没有一个准确定论[4-5]。
TTX相对分子质量为319.27[6]，分子式C11H17N3O8。主要存在于卵巢、肝脏等部位中[7]，含毒量以卵巢和肝脏最高，且性质稳定，普通烹饪手段较难破坏。常见的同系物[8]较多，主要为5-deoxyTTX、11-deoxy、4,9-anhydro TTX、5,11-dideoxy TTX、6,11-dideoxy TTX、5,6,11-trideoxy TTX、4,9-anhydro-5,6,11-trideoxy，见图1。TTX纯品为白色结晶体，在弱酸性溶液中溶解性极好，弱碱环境下会发生自然沉淀。TTX能以两性离子存在，在强酸强碱中均会遭到破坏，强碱可使其破坏为无毒化合物：2-氨基-8羟基-6羟甲基-喹唑啉。
TTX 的分子量较小，结构特殊，易溶于弱酸性溶剂，在强酸和强碱的溶剂中结构易遭到破坏，在20世纪60年代初，国外学者[9-12]对TTX构造进行了深入的研究，经历了15年之久的研究，采用制备衍生物及进行X衍射实验方法等,终于发现TTX 笼形原酸酯类结构，结构中的碳原子全部为不对称取代，在游离状态下以3种形态相互平衡的混合物存在[13]。
图1 河豚毒素及其同系物的分子结构式（图片源于网络）
Fig.1 Molecular structure formula of
tetrodotoxin and its homologues（Pictures from the Internet）
1.3 河豚毒素应用进展
目前，我国渤海、黄海、东海海域一直延申至南海海域，一共生活着形形色色的河豚鱼，共计40多种，一年捕捞量可达数万吨，效益高达几十亿。人们在追求无毒河豚鱼的同时，却遗忘了市场需求量更大的TTX，自从2016年河豚鱼养殖开禁，TTX一直呈现出一种供不应求的状态。据调查，每克TTX粗品市场价达8万元，纯度97%以上的TTX纯品价格为30万元。
TTX作为局麻药，其麻醉作用比一般的麻醉药效果强16万倍，TTX通过对动作电位的阻断来影响人们的生理活动甚至破环神经[14-15]。研究发现[16]癌症病人的疼痛可以通过TTX的注射来进行缓解，效果甚至比临床常用的杜冷丁还好。TTX的作用不仅仅能减轻剧痛，对呼吸系统疾病的缓解，对甲肾上腺素的抑制，对心脑血管系统疾病的缓解都具有特别突出的疗效等[17-18]。在用于缓解癌症晚期的剧烈疼痛和戒毒时，患者不会上瘾，是化学药物和中草药的优良替代品。
2 研究现状
2.1 河豚毒素检测方法
20世纪40年代，Kao[19]开始进行小鼠生物检测法，当一定浓度的TTX被注射进入小鼠体内后，小鼠会呈现出死亡状态，并且死亡时间和TTX含量有一定的线性关系。起先表示TTX毒力的是鼠单位(MU)[20]，在实验条件下，一只20 g的小鼠皮下注射0.2 mL TTX 溶液，10 min死亡的剂量为1个鼠单位。这种方法操作简单，不需特殊设备，但需要大量老鼠，且容易受小鼠个体差异影响，重复性较差。
2.1.2酶联免疫检测法
20世纪80年代，酶联免疫法[21]测定TTX逐渐广泛应用，它是根据抗原与抗体的结合，以及氢键等键能影响衍生出来的一种分析方法。Matsumura[22]采用酶联免疫的方法对TTX进行了定性分析，由于酶联免疫法的灵敏度较高，能够确保这种特异性及定量关系，在筛选水产品中TTX的情况下，一次性可进行大批量实验，但酶联免疫存在着一定情况的假阳性。
2.1.3理化检测法
（1）荧光、紫外分光光度法
荧光法的检测原理是TTX在碱性环境下发生水解产生C9，TTX的含量是通过C9碱来定量的。这是最早建立起来的定量检测TTX的方法，曹爱英等[23]利用NaOH与TTX进行柱前衍生，TTX衍生物在最大激发波长为370 nm，最大发射波长为495 nm条件下具有荧光性。TTX在衍生产生C9的同时，副产物也伴随有同等质量的草酸钠产生，它在230 nm的波长下有明显的紫外光吸收，因此用紫外分光光度法也能对TTX定量检测。荧光、紫外分光光度法均能检测TTX，但灵敏度以及准确度与其他检测的方法相比还是有所欠缺。
（2）薄层色谱法
薄层色谱法[24]是一种比较传统的鉴定手段，具有简单易行，易操作，分离效果好等特点，应用范围比较广泛。该法根据TTX极性比较大这一特性，将它与氢氧化钠进行反应，产生显色物质从而定性测量。点板常用的展开剂为正丁醇：乙酸：水=4：1：2，最低检出限为4.0×10-9
mg/L，但是这种方法只能用于TTX的定性分析，应用并不广泛。
（3）高效液相色谱（HPLC）法
HPLC-荧光检测器（FLD）、紫外检测器（UV）法是实验室中使用最为普遍的检测方法，主要通过不同的检测器对检测物质进行定量。在碱性条件下，将TTX进行衍生，产生的衍生物质具有可见光吸收信号，可以通过荧光检测器或紫外检测器进行检测。荧光衍生的反应机理：TTX分子上有1个pKa值很高、在水溶液中极易质子化、在碱性溶液中非常不稳定的胍基和1个在酸或碱中均易发生水解的原羧酸基。辛少平等[25]对TTX衍生化，优化了色谱条件，建立了新的检测方法，该方法检测限低，灵敏度高，重复性好。
蒸发光散射检测器（ELSD）是通用型检测器，TTX在经HPLC-ELSD检测时有明显的响应，主要由于TTX只有在紫外波长200nm下才有较弱吸收峰，但在ELSD下有明显的折射光。王小逸等[26]联合使用HPLC-ELSD，对TTX进行纯化研究，以YWG-C18为色谱柱，发现ELSD检测灵敏度高、检测限低，同时还具有良好的线性，基线非常平稳，在检测分析方面有着良好的性能。
（4）HPLC-MS/MS法
HPLC-MS/MS是近些年国内外研究热点，主要通过对目标离子进行轰炸，产生多个离子碎片，对响应最高的子离子再次碎裂，最终得到定性、定量离子片段，以此对目标物质进行分析。免疫亲和柱净化-HPLC-MS/MS是目前使用频率最高检测TTX的方法。免疫亲和柱是利用TTX与柱填料内小鼠腹水特异性识别的特点，TTX以小鼠腹水作为载体发生结合，随后去除基质，达到净化的效果。严忠雍[27]开发的免疫亲和柱净化-UPLC-MS/MS法，线性范围广、灵敏度高，检测限低至0.3 ng/mL，远远低于其他检测TTX的方法，此方法应用非常广泛。
（5）GC-MS/MS法
随着质谱技术的发展，GC-MS/MS凭借超强的定性能力，已经成为最有效、最准确的检测分析方法之一。气相色谱-质谱法主要利用TTX水解产生的衍生物，经净化、衍生化后进行全扫描方式检测，定量离子392。吴平谷等[28]对该法进行了优化，选择的色谱柱为：HP-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱，不分流进样，流速控制在110 ml/min。建立了比较完善的TTX前处理及气相色谱-质谱法检测体系，具有灵敏度高、重复性好等众多优点。
近年来，众多新兴技术逐渐进入大众的视线，仿生纳米酶因其具有结构简单、化学性质稳定的特点引起了广泛关注，张金艳等[29]，通过基于氧化石墨烯修饰的金属网作为捕获探针, 以及 AuPtRh 三金属纳米酶连接核酸适配体作为信号探针，开发出了一种SSM-GO/AuPtRh-aptamer传感器对河豚毒素进行捕获。
2.2 河豚毒素提取、纯化工艺现状
2.2.1 河豚毒素的提取
TTX主要用酸性水溶液或酸性甲醇溶液提取，陈成添等[30]采用热甲醇法、微火煮沸法、沸水浴法对河豚鱼混合卵和混合肝进行毒素提取，发现水浴提取效果较佳。黄枝梅等[31]则通过超声辅助提取替代了水浴提取TTX，大大地提高了对TTX提取的效率。
2.2.2河豚毒素的分离技术
（1）中性氧化铝柱层析法
中性氧化铝具有多空疏松结构，能够进行物理吸附。较早就有报道，日本学者[32]用一系列方法提取粗品TTX溶液，而后，用氧化铝柱纯化制备，得到LD50为13 μg/kg的TTX，这也是最早的提纯TTX的方法。
（2）活性炭柱层析法
活性炭是种吸附性能极强的非极性物质，无固定形状，因其孔径繁多而使表面积增大，这一特性使得在吸附物质时效果更好于其它吸附剂。当对TTX提取液进行吸附纯化时，大部分色素及组织能被活性炭保留，极性较大的TTX反而能够被洗脱下来，但不足的是TTX的毒力也会有一定的损失。根据这一原理，王智等[33]利用C18进行萃取，作为前处理的净化方法开发了UPLC-MS/MS法测定食品中的TTX，该方法回收率高、重复性好，精密度与准确度都能满足日常监测需求。
（3）离子交换柱层析法
离子交换树脂柱层析法是是现阶段使用比较广泛的一种提纯手段。TTX在弱酸性溶液中以铵盐C11H16O8N2NH2+存在，在溶液中与离子交换剂进行结合，因为各组分之间的亲和力不同而使TTX达到分离的目的。该法主要选择D152，D101等几种型号的离子交换树脂。黄枝梅等[34]对D152树脂吸附TTX进行了详细的报道，从吸附方式、样液pH、洗脱工艺等几个方面深入探究了层析条件，该方法为TTX大规模化制备提供了坚实的理论基础。
（4）凝胶柱层析法
凝胶柱层析法主要机理是分子筛效应，当TTX提取液用来柱层析纯化时，进入孔径较小凝胶柱后，较大分子的蛋白质，色素类物质因为被阻挡不能进入凝胶孔隙中，而较小的分子的TTX则能进入凝胶孔隙，加入一定量的洗脱剂，蛋白质类分子就随洗脱剂从凝胶间隙洗脱下来，受到的阻力越小，能够越快地从柱床馏出，TTX分子物质则从上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中，这样多次反复，大分子物质首先从层析柱床中馏出。Firoz Ahmed[35]采用Bio-gel公司的P2型号凝胶进行柱层析纯化，使TTX纯度提升至45%以上。
（5）膜分离技术
膜分离技术主要根据分步截取不同分子量物质的原理进行纯化。易瑞灶等[36]主要通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜等多级膜分离技术制备高纯度TTX，通过此技术将TTX纯度提升至99%以上，并能进行规模化生产。
2.3 河豚毒素风险评估现状
TTX风险评估是对居民日常消费的水产品中TTX含量的一项调查研究。目前，对河豚毒素的风险评估调查较少，田良良等[37]对养殖河豚鱼中河豚毒素的暴露及安全限量进行了探讨。而其他水产品包括贝类、鱼、虾、蟹等品种的污染状况研究却不见报道。杨双喜等[38]对宁波市市售水产品TTX污染状况进行了调查，总体表现为相同品种的水产品，冬春季节毒力含量大；种类差异较大，检出的主要品种为贝类；阳性率高，但含毒毒力较低。
3 展望
河豚毒素最大的问题是价格较高，其作为Na+通道阻滞剂，独特的性质在医药方面发挥着巨大的作用，由于生物体内TTX含量较低，药企的原料供应面临着严峻的考研，导致价格一直居高不下，因此进一步的人工合成也成为了各位科学工作者的研究方向。而安全性是TTX药物的另一关键性问题，国外已经有相应的河豚毒素制剂问世，我国对TTX药物的研发尚且处于空白状态。科研人员对药物的研发包括毒理性、安全评价等重复性实验，临床上对安全剂量[39-40]进行层层把关。一旦以河豚毒素为原料相关药品惠及大众，医学界的许多疑难问题或将迎刃而解。
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作者简介: 王世光(1970- )，男，浙江舟山人，助理工程师,研究方向：天然产物的提取与分离.
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