采用乐高拼接法模拟T4噬菌体型DNA拓扑结构

　　

采用“乐高”拼接法模拟“T₄噬菌体”型DNA拓扑结构

谈浚杰¹，李明坤^1,2,孟子汶^1,2, 毕美营^1,2 ,韦佳勋^1,2, 汪朝阳^1,2, 应明^*1,2

(¹天津理工大学化学化工学院，生物制药工程系，天津 300384:2天津理工大学化学化工学院，天津市有机太阳能电池与光化学转换重点实验室，天津 300384)

摘要： DNA链由于其良好的可控性和之间具有相互的作用，是合成纳米结构的理想材料之一。DNA纳米技术利用沃森-克里克碱基互补配对的特异性构建二维或三维结构。现如今，DNA纳米技术可以用于药物递送、生物成像和病毒检测、治疗等诸多方面。然而，使用传统DNA折纸的折叠方法只适用于尺寸小且结构简单的纳米结构。对于大型和复杂的结构，通常需要单独组装和纯化多个长股以进行超级组装，并且实验过程复杂且要求严格。基于我们对DNA折纸的研究，我们的团队提出了一种新的核酸设计方法——“乐高”拼接，这种方法依赖于两种基本结构：梁和销。重复折叠到目标结构中的原始长股链被拆分为多个短股链，因此完整的目标结构由多个独立模块组成，这些模块由拆分的短股形成，这些短股被称为梁。模块结构的稳定性和模块之间的互连需要大量“订书钉链”的参与，我们称之为销。此外，我们改进了DEADALUS算法，通过查找索引基序的数目替换原始序列，并添加了添加限制位点的功能。因此，模块也可以通过在梁上的特定位置添加限制位置而彼此连接。与DNA折纸相比，“乐高”块拼接具有更大的灵活性，可以将简单的结构组装成复杂的结构，并且结构的大小不受链长度的限制。在这项研究中，我们在T₄噬菌体的设计中使用了“乐高”块拼接。我们将T4噬菌体分为四部分，并将其组装成模块。由梁和销组成的15个模块构成噬菌体头部。噬菌体颈部、尾部和底板。头部和颈部由九个模块组成，尾部由十个模块组成。底板由六个模块及其相应的销组成。将AbsI限制位点添加到组装头部的特定位点，将AbsI和BbvCI限制位点添加至套环的特定位点、将BbvCl和XbaI限制位点添加于鞘的特定位点以及将XbaI约束位点添加至基板。通过限制位点形成的粘性末端，每个模块被正确地顺序连接，最终形成目标结构。最终设计的T₄噬菌体的头部高度为100nm，直径为60nm，鞘直径为15nm，高度为70nm。真实噬菌体头部的高度为95nm，直径为85nm，鞘的直径为10nm，高度为95纳米。由于噬菌体颈部细长，头部中部结构致密，头部不易在垂直方向被压缩和拉伸，而头部上下端结构相对松散。据预测，在自组装过程中，由于重力的作用，颈部很容易拉伸和增加，而头部将在垂直方向上受到压缩，导致高度降低，直径增加。经过比较，设计结果基本符合噬菌体结构的大小。

关键词：核酸自组装，“乐高”拼接，T₄噬菌体

Simulation of T₄ phage-DNA topology particles through “Lego” splicing

TAN Junjie¹，LI Mingkun^1,2,MENG Ziwen^1,2, BI Meiying^1,2 ,WEI jiaxun^1,2,WANG Zhaoyang^1,2,YING Ming^*1,2

（¹Department of Biopharmaceutical Engineering, School of Chemistry and Chemical Engineering, Tianjin University of Technology, Tianjin 300384；²Tianjin Key Laboratory of Organic Solar Cells and Photochemical Conversion School of Chemistry and Chemical Engineering, Tianjin University of Technology, Tianjin 300384）

Abstract:DNA is one of the ideal materials for synthesizing nanostructures because of its good controllability and the interaction between DNA strands. DNA nanotechnology uses the specificity of the complementary pairing of The Watson-Crick base toconstruct two - or three-dimensional structures. Today, DNA nanotechnology can be used in cells for drug delivery, bioimaging and virus detection, treatment, and more. However, the folding method using traditional DNA origami is suitable for nanostructures with small size and simple structure. For large and complex structures, multiple long strands are often required to be separately assembled and purified to carry out super assembly, and the experimental process is complex with strict requirements. Based on our research on DNA origami, our team proposed a new method for nucleic acid design: “Lego” block splicing. This method relies on two basic structures: beams and pins. The original long strand that is repeatedly folded into the target structure is split into multiple short strands, so that the complete target structure is composed of multiple independent modules, which are formed by the split short strands, and these short strands are called beams. The stability of the module structure and the interconnections between the modules require the participation of a large number of staple chains, which we refer to as pins. In addition, we improved the DEADALUS algorithm by looking for and replacing the original sequence by the number of the index motif, and added the function of adding restriction sites. Therefore, the modules can also be connected to each other by adding restriction sites at specific locations on the beam. Compared to DNA origami, “Lego” block splicing has more flexibility to assemble simple structures into complex structures, and the size of the structure is not limited by the length of the chain. In this study, we used the "Lego" block splicing in the design of the T₄ bacteriophage. We divided the T₄ bacteriophage into four parts and assembled it in modules. The 15 modules composed of beams and pins constitute the phage head. The composition of the phage collar,sheath and baseplate is the same as that of the head. The collar is composed of nine modules, the sheath is composed of ten modules, and the baseplate is composed of six modules and their corresponding pins respectively. The AbsI restriction sites were added to the specific site of the assembled head, the AbsI and BbvCI restriction sites were added to the specific site of the collar, the BbvCI and XbaI restriction sites were added to the specific site of the sheath, and the XbaI restriction sites were added to the baseplate. Through the sticky ends formed by the restriction sites, each module was correctly connected in sequence, and the target structure was finally formed. The final designed T₄ phage has a head height of 100nm, a diameter of 60nm, a sheath diameter of 15nm, and a height of 70nm. The height of the real phage head is 95nm, the diameter is 85nm, the diameter of the sheath is 10nm and the height is 95nm. Because the phage sheath is slender and the structure in the middle of the head is dense, it is not easy for head to be compressed and stretched in the vertical direction, while the structure of the upper and lower ends of the head is relatively loose. It is predicted that the sheath is easy to stretch and increase due to the action of gravity during self-assembly, while the head will be compressed in the vertical direction, resulting in the decrease of height and the increase of diameter. After comparison, the design results basically accord with the size of phage structure.

Keywords: Nucleic acid self-assembly, “Lego” block splicing, T₄ phage

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基金项目：大学生创新创业训练计划（202110060078）。

第一作者：谈浚杰（2000—），男，本科生在读，研究方向为分子生物学。E-mail:294365028@qq.com。 通信作者：应明，副教授，硕士导师，研究方向为分子生物学与基因工程。E-mail:ym@tjut.edu.cn。

DNA是一种众所周知的携带遗传信息的天然分子。在过去的三十年中，DNA由于其可预测和可编程的构象、A-T和C-G的Watson- Crick碱基配对原理以及存在丰富的酶等这些工具来操纵DNA，已被普遍用作核酸纳米结构的分子构建模块。DNA结构在分子水平上的可预测性优于构建纳米结构的任何其他生物分子。此外，DNA纳米结构还具有良好的生物相容性、柔韧性、机械稳定性、高负载能力、高组织渗透性和足够的生物流体稳定性，这有利于其在体内外的应用。所有这些特征使得纳米核酸结构适用于仿生系统^[1][2][3][4]、诊断^[5]和人类健康治疗^[6][7][8]。例如，选择核酸纳米结构作为强病毒载体材料。Anderson等人开发了具有清晰尺寸的自组装DNA四面体纳米颗粒，以将siRNA引入细胞并沉默肿瘤中的靶基因^[9]。免疫系统还影响DNA纳米结构的体内应用。使用模拟自身物质的“伪装”DNA纳米结构可以帮助它们逃离免疫系统^[10][11]。它在疫苗研发和核酸医用生物材料方面发挥着重要作用。

DNA纳米结构的设计通常包括长链路径、订书机放置和序列测定。为了实现更精细的控制和合成更复杂的结构，科学家提供了几种不同的组装方法，主要包括DNA瓦片、DNA折纸和DNA砖。常见的瓦片结构包括n分支结构、DX瓦片和n星形点。1983年，Seeman等人通过不完全互补将四条DNA单链配对，形成DNA 4分支结构^[12]。随后，科学家在实验室合成了一系列n支化结构，如5支化结构^[13]，6支化结构更灵活，不利于获得更大的结构。DNA构建模块需要一定的刚性才能形成更大的结构。Seeman等人通过引入两个DNA双螺旋之间的交叉来构建DX瓦片结构。DX瓦片结构具有比DNA双链更好的刚性，因为它具有两个交叉^[15][16]。为了合成更复杂的DNA结构，毛承德等人在2008年设计了三点星形结构模块^[17]，通过三点星形的自组装获得了DNA四面体^[17]、十二面体和32面体^[18]。2006年Rothemund提出的DNA折纸是纳米结构设计史上的一个里程碑^[19]。DNA折纸设计分五个阶段。在第一步中，手动生成具有DNA结构信息的矩阵框图，在第二步中，通过框图通过光栅手动填充折叠路径。第三步是通过计算机编程基于框图和折叠路径的第一步设计。第四步是细化螺旋域的长度，以最小化设计中的应变力。第五步是骨折和关节。2012年，尹鹏提出了DNA砖方法。该方法以不同方式连接数千个寡核苷酸，以形成任意形状的纳米结构^[20]。

尽管DNA结构纳米技术正在以惊人的速度发展，但复杂3D纳米结构的从头设计仍然是一项费时费力的工作。在日益增长的功能化需求的推动下，科学家们开发了一系列基于不同方式的建模工具和可视化程序。本文主要介绍了DEADALUS算法程序^[21]，这是一个完全独立的设计过程。它计算出ssDNA序列被折叠成任何所需的3D形状。它使用基于表面的靶的简单三维几何表示来自动生成合成靶所需的ssDNA，该ssDNA可以折叠成具有高结构保真度和良好生物相容性的纳米结构。通过选择目标结构、计算生成树、添加伪节点和支架路由、添加稳定链、生成序列和预测原子级3D结构，实现了具有几乎任意结构的3D DNA组装的全自动、自上而下的序列设计，这为非专家提供了设计和合成DNA分子结构的能力。

在我们研究的先前研究中，SdhC双链DNA用于折叠，通过核酸自组装成功设计并获得预期边长19.05nm的正四面体核酸纳米锥^[22]。构建了一种新的方法，即普通基因的双链DNA可以取代单链M13mp18核酸作为DNA折纸的核酸材料。在此基础上，自主设计了核酸纳米盒的组装^[23]。通过选择citZ基因并用特定基因位点修饰，通过计算和自组装获得边长为47.29nm的核酸纳米盒，并通过限制酶控制核酸纳米盒的开关。打开的核酸纳米盒与在限制位点修饰的质粒混合，并在转移到原生质体之前与T4连接酶连接。实验表明，100%的包裹质粒被转移到革兰氏阳性细菌中，这表明核酸纳米盒有望成为一种新的药物载体。

上述研究表明，模块拼接核酸纳米材料的构建方法比DNA折纸更为人工，可以使用普通的双链DNA序列作为纳米结构的核酸材料，甚至可以定制纳米结构并且所构建的纳米结构更完整。因此，我们使用“乐高”区块拼接将T₄噬菌体分为四部分进行区块拼接和组装。首先，我们选择人类基因组基因PPIAP5的基因序列作为头部15个模块的材料，选择HSBP1P2的基因序列为衣领中的9个模块和底板中的6个模块的素材，选择NDUFB3P3的基因序列用作鞘中的10个模块的材料。其次，使用DEADALUS算法，为了使设计的结构满足T₄噬菌体的大小、构建目标结构的所有顶点的空间坐标、顶点之间的连接性以及顶点应提供的表面（图2A至B）。除了提供上述空间信息外，边长不能小于31bp，并且是10.5bp的倍数。因此，T₄噬菌体的最小边长被设计为31bp。最后，使用改进的DEADALUS修改相应模块的原材料，在特定位点添加限制性位点，并拼接每个位点，从而最终形成预期的T4噬菌体结构。

1 靶模型：T₄噬菌体

在这项研究中，我们的目标是用复杂的对称外壳模拟T4噬菌体病毒，大多数是病毒外壳或二十面体对称或螺旋对称，但痘病毒和大型噬菌体病毒不属于其中任何一种。痘病毒是最大的动物病毒（约400nm×240nm×200nm），外观呈椭圆形或砖状，内部结构非常复杂，但大型噬菌体病毒比痘病毒更复杂。对大肠杆菌T₄噬菌体病毒进行了仔细研究。它们的头部类似于二十面体结构。尾部由套环、中空尾管、围绕尾管的尾鞘和复杂的底板组成。颈部将头部和尾部连接在一起。具有二十面体对称头部和螺旋对称鞘，T₄噬菌体病毒（头部直径约为85 nm，鞘直径约为10 nm，长度约为95 nm）具有二元对称结构（如图1所示）。

图1 左边是T4噬菌体的结构，右边是T4噬菌体扫描电子显微镜

2 设计和预测算法

生成生成树程序将输入单链折叠到目标结构的框架中，并生成折叠所需的订书钉股线。为了使单个支架链能够形成完整的目标结构，必须满足两个条件。第一个条件是必须有一个欧拉回路，因为支架的两端将形成彼此相邻的支架间隙，并且该间隙必须由多余的缝钉填充。为了确保欧拉电路的存在，当每个顶点的阶数为偶数时，结构中的每条边可以实现偶数个双工。第二个条件是，即使欧拉电路存在，也不能保证所有的欧拉电路都能形成有效的支架结构。为了形成有效的支架结构，在设计曲面属性元素时，从某个顶点输入某个顶点。边的脚手架链可以从同一顶点或另一顶点离开。因此，解决支架路径的问题可以概括为：将边缘划分为一个具有零支架交叉或一个支架交叉的边缘。具有零支架交叉的边必须连接到每个顶点，并且没有循环，这满足生成树的定义，因此使用生成树来解决支架布线（图2C），并且prim算法用于找到最小权重并重新生成树（顶点集是V，边集是e，X是集合V中的任何顶点。算法从顶点X开始，每次选择一个最接近当前顶点集的顶点，并将两个顶点之间的边添加到树t并重复）

图2.DEADALUS算法图解

添加伪节点和支架布线对于零支架交叉的边，添加一对伪节点以将边分成两半，每一半对应于支架交叉的一侧（图2.D）。对于图形中的每个顶点，将添加一组伪节点来替换顶点节点，对于每个面，将放置一个伪节点，以连接两个边界边并将其与其他边断开。添加伪节点后，定义了脚手架将通过的欧拉电路（图2E和F），它有两种电路：顺时针布线和逆时针布线。为了最小化骨架的静电排斥，选择了逆时针运行支架的路线。生成树和伪节点仅与结构相关，与大小无关。然后，将边缘的长度引入算法（图2插图），并将支架切口位置放置在没有支架交叉的边缘上，远离缝钉切口和交叉点的复合结构。使用prim算法，根据边缘的长度和布线方案对每个支架底座进行编号，并跟踪其在边缘上的相对位置。对于每条边缘，一个核苷酸从5'和3'端突出，算法确定任何给定边缘上支架片段的长度。

表1. 边缘的长度引入算法

添加缝钉链并生成序列每个支架底座都有两条与其相关的信息，一条是其在支架链上的位置，另一条是它在空间中的位置。这两条信息用于标识要与基部配对的订书钉链中的基部序列，然后为订书钉分配基部索引号。有三种类型的缝钉股线，顶点上的缝钉，有支架交叉的边上的缝，以及没有支架交叉的边缘上的缝。顶点缝钉的类型取决于顶点的度数，长度为52bp或78bp。为了确保具有高特异性和结合强度的连续10-11bp双链，该系统在某些地方使用单个交叉（n是顶点的度数，表示顶点连接的边数，a和b是顶点上52nt长度和78nt长度的缝钉链的数量）。

预测原子级3D结构对于具有支架交叉的边缘，将两个31-32nt缝钉放置在支架交叉处，以充分加强结合。对于边缘的其余部分，如有必要，用42nt缝钉、22nt或21nt短缝钉填充（图2G）。每个缝钉由数字向量表示，与支架核苷酸配对，然后使用输入或生成的支架序列与相应的支架编号匹配。采用通用算法确定边缘端点的位置。Dx瓦片可以被视为两个组合宽度为4nm（2nm螺旋间距和2nm双工直径）的平行圆柱体，其可以进一步简化为具有4nm宽度的矩形。在理想情况下，这些矩形的角度相交，矩形的宽度相加形成一个N边正多边形。多边形的内径是从边的中心到边的垂直距离（s是顶点和DX平铺边的起点之间的距离，r是由DX平铺的宽度形成的多边形的半径，θtot是顶点的所有面角之和）。

然而，并不是所有的顶点都有相同的角度，会有骨干延伸或核苷酸重叠的情况，所以定义s=r为角的延伸，并创建一个半径为r的球体来定义边缘边界（是最大的面角度，是DX-tile的宽度）。这种方法适用于所有的规则结构。

3 设计限制性酶位点

如果设计完整的结构，T4噬菌体结构的设计需要大于20000bp的支架序列。在实际的实验组装过程中，出错的概率太大，因此我们使用“乐高”块拼接将T4噬菌体分为四个部分（头部、衣领、鞘和底板）。它们各自产生的结构通过限制酶切割和连接，以实现复杂结构的模块组装。因此，算法的改进可以在脚手架序列上添加限制点，因为算法具有脚手架上的基础序列号，由txt文件生成以检查基础是否安排在每种情况和基础序列的位置，通过查找需要替换的基础序列的位置，替换相应的酶限制位点序列（这里是改进的程序）。

4 结果与讨论

通过DEADALUS算法的应用，我们成功地设计了T4噬菌体四个模块的纳米结构。根据算法流程，首先选择目标结构的几何模型。因为我们将噬菌体组装成模块，所以完整的噬菌体被分为四个几何模型（图3）。以头部几何模型为例，制作了头部的Schlegel图，计算了生成树和支架路径，添加了伪节点和缝钉，将A链折叠成噬菌体头部结构。在此基础上，使用“乐高”积木拼接法，将折叠成头部结构的长股分成15根梁。每个梁构成头部结构的一个模块（如图4所示）。15个模块与算法生成的引脚组合，以模块组装的方式生成噬菌体头部结构。其他三种结构类似。轴环由九个模块组成（如图5所示），护套由十个模块构成（如图6所示）。底板由六个模块组成，如图7所示。由于组装的四个模块需要通过相应的粘性端拼接，因此分析了包括四个模块的梁的限制位置。因为每个模块之间的连接位置和连接顺序是固定的，所以必须将头部连接到上套环，下套环必须连接到上护套，下护套必须连接到基板。因此，头部和轴环顶部、轴环下端和护套顶部、护套下端和基板的限制位置应相同，三个连接位置的限制位置不应相同，以确保每个模块之间的正确连接。此外，上述三个核酸序列中必须不存在作为每个模块束的合格限制位点，以防止限制酶切割在每个模块连接期间不应断裂的束，导致模块解体。因此，我们需要三个不同的限制位点，这些位点在三个射束中不存在，使用Snapgene软件分析限制位点，发现了三个限制位点，AbsI（CC^TCGAGG）、BbvCI（CC^TCAGC）和XbaI（T^CTAGA）（图s1显示了限制位点的位置）。因此，我们使用改进的DEADALUS算法在四个模块上添加这些限制点

图3.模块算法图（a）是噬菌体头部的算法图流程。选择噬菌体头部模型，投影头部的施莱格尔图，计算施莱格尔图表上的最小生成树，将平面生成树转换为3D生成树，并在非生成树路由上添加缺口（粉色是生成树，蓝色是没有支架交叉的施莱盖尔图），以定义欧拉电路，根据边缘长度和是否有刻痕，在顶点和边缘添加特定的订书钉链。（b） 是噬菌体颈部算法流程图，（c）是尾部算法流程图和（d）是底板算法流程图。

4.1 核酸材料

对于不同的噬菌体模块，我们选择不同的核酸材料以适应由梁组成的模块的长度。对于噬菌体的头部，我们选择PPIAP5，PPIAP5是肽基丙酰异构酶A假基因5。PPIAP5的基因ID为122842，全长574bp，位于智人14号染色体GRCh38的59181571-59182144位置，我们选择了HSBP1P1，HSBP1P2是热休克因子结合蛋白1的假基因2。HSBP1P基因的ID号为326296，全长538bp，位于智人4号染色体GRCh38的110251617-110252126位置，位于智人14号染色体GRCh38的53011929～53012401位置。这些核酸材料均为假基因，我们选择了这三个基因以避免干扰正常转录。

4.2 头部

T₄噬菌体的头部需要长度为8190bp的碱基序列，并选择15个基于PPIAP5的射束。修改了五束（表S5至S8），第一束的长度为154bp（表S4）。15个分散的射束被大量的针组合以形成噬菌体的头部模块。分析后，AbxI限制位点位于头部E(V₁₄-V₁₉),E(V₁₃-V₁₈),E(V₁₂-V₁₇),E(V₁₆-V₂₁),E(V₁₅-V₂₀)的五个侧面，以连接到颈部（图8a）。

图4.由头部组成的15个模块

4.3 颈部

颈部需要长度为4752bp的基础序列。选择了基于HSBP1P1的九个波束。修改了六个波束（表S9至S14），第一个波束的长度为448bp（表S99）。AbxI限制位点位于轴环E(V₂₀-V₂₉),E(V₁₉-V₂₈),E(V₁₈-V₂₇),E(V₁₇-V₂₆),E(V₂₁-V₃₀)的五侧，以连接至头部，BbvCI限制位点位于颈部E(V₂₅-V₄),E(V₂₄-V₃),E(V₂₃-V₂),E(V₂₂-V₁)的四侧，以与尾部连接（图8 b和c）。

图5.由颈部组成的九个模块

4.4 尾部

尾部需要4584bp长度的碱基序列。选择了基于NDUFB3P3的十个波束。修改了七个波束（表S15至S21），修改后的第一个波束为327bp（表S14）。BbvCI限制位点位于snath E(V₆-V₂₆),E(V₉-V₂₇),E(V₁₂-V₂₈),E(V₃-V₂₅)和E（V₃-V₂₅）的四个侧面，以连接到颈部，XbaI限制位点位于E(V₁-V₂₁),E(V₄-V₂₂),E(V₇-V₂₃),E(V₁₀-V₂₄)的四侧，以连接到底板（图8 d和E）。

图6.由尾部组成的十个模块

4.5 底板

底板需要长度为3168bp的碱基序列。选择了基于HSBP1P1的六个波束。修改了三个波束（表S22至S24），第一波束的长度为478bp（表S24）。XbaI限制部位位于底板E(V₁₅-V₁₉),E(V₁₄-V₁₈),E(V₁₃-V₁₇),E(V₁₆-V₂₀₎的四个侧面，以连接到尾部（图8f）。

图7.由底板组成的六个模块

4.6 靶结构组装

噬菌体的四个结构设计完成并添加限制位点后，应将四个单独设计的结构拼接成完整的噬菌体结构。“乐高”区块拼接用于用限制性内切酶切割靶结构的限制性位点。由于头部和颈部、尾部、底板对应于粘性末端，因此可以与DNA连接酶连接。一对一连接后，可以形成完整的噬菌体结构。

图8.限制部位（a）处缝钉股线的方向是头部限制部位的位置和缝钉的方向。切割后，a与b连接。（b）是颈部上端的限制部位的位置和缝钉的方向。（c） 是套环下端的限制部位的位置和缝钉的方向。切割后c与d连接。（d） 是尾部上端的限制部位的位置和缝钉的方向。（e） 是尾部下端的限制部位的位置和缝钉的方向。e切割后与底板连接。（f） 是底板上限制部位的位置和缝钉的方向。

5 结论

项目团队开发了一种使用“乐高”块拼接和DNA纳米结构的计算机辅助设计来模拟T₄噬菌体病毒衣壳的自组装方法，并可以通过这种方法模拟各种形状的病毒衣壳。基于自主开发系统的病毒模拟研究可以产生两种效果。首先，它在DNA设计理念上取得了突破，并开发了适合光谱基因的“乐高”块拼接。这种构建方法将为会计纳米技术提供新的学术思路。第二，DNA模拟病毒衣壳颗粒的实验组装如果成功，将改变创伤疫苗的生产方式。它为开发更多的核酸奠定了基础。

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