UHPLC-MS/MS法定鸡蛋中11种头孢菌素的残留量
洪丽
（福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量检验检测中心，福建福州 350002)
摘要：采用UHPLC-MS/MS技术建立了鸡蛋中11种头孢菌素含量的同步测定方法。鸡蛋样品采用60%乙腈溶液进行超声波提取，离心后以阴离子小柱（PAX）净化除杂后，再以UHPLC-MS/MS进行分析测定。在最优条件下进行方法验证，在0.5 ng/mL ~ 50 ng/mL浓度范围具有较好的线性关系，11种头孢菌素的相关系数（R2）均高于0.99；鸡蛋中头孢菌素的检出限（LOD）均为0.2 μg/kg，定量限均为0.5 μg/kg；以阴性鸡蛋样品为基质分别添加1、2、10 μg/kg的加标回收试验（n = 6），11种头孢菌素的平均回收率在81.7% ~ 97.1%之间，平行实验的RSD在2.8% ~ 6.8%之间。建立的方法具有高灵敏度、高准确度和高精密度的特点，可用于鸡蛋中11种头孢菌素含量的测定。
关键词：UHPLC-MS/MS；头孢菌素；鸡蛋
Determination of eleven Cephalosporin Residues in egg by UHPLC-MS/MS
Hong Li
(Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality, National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food, Fujian Fuzhou 350002, China)
Abstract: A method was established for the simultaneous determination of 11 kinds of cephalosporin residues in egg by UHPLC-MS/MS. The samples were extracted by 60% acetonitrile solution, purified by mixed anion solid phase extraction column (PAX), and finally analyzed using UHPLC-MS/MS. The results showed good linearity in the range of 0.5-50 ng/mL, and the correlation coefficients （R2）were more than 0.99. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were 0.2 μg/kg and 0.5 μg/kg, The average recoveries and relative standard deviation were 81.7% - 97.1% and 2.8% - 6.8%, respectively in the spiked of 1μg/kg 、1μg/kg and 10μg/kg. The method has high sensitivity, accuracy and reproducibility, and is suitable for the determination of 11 cephalosporin residues in egg.
Keywords: UHPLC-MS/MS； Cephalosporin； Egg
头孢菌素是一类含有β内酰胺环的抗生素。该类抗生素具有广谱抗菌特性，毒副作用小，因此在人类和动物的疾病治疗中广泛应用[1]。然而，在动物饲养过程中，滥用头孢菌素会导致药物在动物体内积累，进而产生超级细菌。这些细菌可能通过食物链进入人类体内，对健康造成潜在威胁[2-4]。为此，全球各国已制定了动物源性食品中头孢菌素残留的最大限量，其中包括中国、日本、美国和欧盟。在中国最新的兽药残留限量标准（GB31650-2019）中，规定了头孢氨苄、头孢喹肟和头孢噻呋在动物源性食品中的限量分别为0.2 mg/kg、0.05 mg/kg和1.0 mg/kg。然而，该标准只针对这三种头孢菌素设定了限量，而其他头孢菌素则没有相应的规定。此外，该标准只适用于肉类，未对鸡蛋中的头孢菌素残留限量做出明确规定。然而，中国是鸡蛋生产和消费大国，因此建立一种准确、高效的同时检测多种头孢菌素的鸡蛋检测方法具有重要现实意义。
目前，有多种方法可用于头孢菌素的检测。其中，高效液相色谱法[5-6]和毛细管电泳法[14]的灵敏度较低且易受干扰；电化学法[15]和流动注射化学发光法[16-18]的效率较低且重现性较差。相比之下，液相色谱-串联质谱法结合固相萃取技术，具有更高的灵敏度和更强的抗干扰能力，同时前处理方式更为简单，已成为目前食品检测行业中最广泛使用的分析方法。现有的国家标准方法[19-22]针对的主要是肉类、水产品、牛奶蜂蜜等基质，缺少鸡蛋中头孢菌素的测定方法，文献也未见报道。因此，本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法，结合固相萃取技术，建立了鸡蛋中11种头孢菌素的测定方法，为今后鸡蛋中头孢菌素的监管提供技术支撑。
1材料与方法
头孢氨苄（CAS号：15686-71-2）、头孢拉定（CAS号：38821-53-3）、头孢唑林（CAS号：25953-19-9）、头孢哌酮（CAS号：62893-19-10）、头孢乙腈（CAS号：10206-21-0）、头孢匹林（CAS号：21593-23-7）、头孢洛宁（CAS号：15686-71-2）、头孢喹肟（CAS号：98753-19-6）、头孢噻肟（CAS号：63527-52-6）、去乙酰基头孢匹林（CAS号：38115-21-8）、头孢噻呋（CAS号：80370-57-6）均购自于天津阿尔塔公司，浓度均为100 μg/mL的液体单标；所用有机试剂均为色谱纯；水为一级水。
1.2 仪器与设备
液质联用仪：1290液相色谱（安捷伦）- 5500（AB SCIEX）串联质谱；称量天平（JY3003，1mg感量，广州市予华仪器有限公司）；涡旋器（MixMax，ABSON公司）；超声波洗器（HU3120B，恒奥有限公司）；离心机（4R Pro，赛默飞公司）； UPLC HSS T3色谱柱（2.1×150 mm，1.8 μm，沃特世公司）；MAX阴离子固相萃取柱（3 mL / 60 mg，沃特世公司）。
1.3 试验部分
1.3.1 色谱条件
色谱柱：UPLC HSS T3（2.1×150 mm，1.8 μm，Waters 公司）；流动相A：0.02 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸），流动相B：甲醇；流速：0.3 mL/min，洗脱程序：0 ~ 6 min，5%B ~ 90%B；6.00 ~ 8min，90%B ~ 90%B；8.00 ~ 8.01min，90%B ~ 5%B；8.01 ~ 10.00 min，5%B ~ 5%B。
1.3.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI+）；扫描模式：多反应监测 (MRM)；离子化电压：5500 V；Gas1气压：50 psi；Gas2气压：50 psi；反吹气气压：35 psi；离子源温度：600 ℃；质谱参数见表1。
表1 质谱参数
Table 1 spectrometric parameters
化合物 | 母离子（m/z） | 碎片离子（m/z） | 去簇电压（V） | 碰撞能量(eV) |
头孢氨苄 | 348.0 | 106.0* | 100 | 30 |
158.0 | 100 | 22 | ||
头孢拉定 | 350.0 | 158.0* | 85 | 15 |
176.0 | 85 | 15 | ||
头孢唑林 | 455.0 | 156.0* | 90 | 16 |
323.0 | 90 | 10 | ||
头孢哌酮 | 646.1 | 143.0* | 120 | 35 |
530.1 | 120 | 10 | ||
头孢乙腈 | 362.1 | 178.0* | 100 | 15 |
258.0 | 100 | 9 | ||
头孢匹林 | 424.1 | 152.1* | 95 | 22 |
292.1 | 95 | 12 | ||
头孢洛宁 | 459.1 | 152.0* | 87 | 17 |
337.0 | 87 | 8 | ||
头孢喹肟 | 529.1 | 134.0* | 65 | 15 |
396.0 | 65 | 10 | ||
头孢噻肟 | 456.0 | 167.0* | 100 | 18 |
396.0 | 100 | 8 | ||
去乙酰基头孢匹林 | 382.1 | 112.0* | 96 | 26 |
152.0 | 96 | 20 | ||
头孢噻呋 | 524.0 | 99.0* | 120 | 38 |
241.0 | 120 | 16 |
注：*为定量离子
1.3.3 标准中间液及标准系列曲线的配制
准确移取各标准溶液100 μL至10 mL容量瓶，以甲醇稀释得到11种头孢菌素浓度均为1.00 μg/mL的标准中间液，再准确分取适量的标准中间液，以10%乙腈溶液稀释成浓度分别为0.5 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.0 ng/mL和50.0 ng/mL的标准工作系列，待测。
1.3.4 样品前处理
称取鸡蛋样品2.0 g，加入5 mL 60%乙腈溶液置于超声波中提取30 min后，以5000 r/min离心并转移上层清液，残渣再加入5 mL 提取液再提取1次，合并两次提取液，经采用3 mL甲醇、3 mL水活化后的MAX柱净化，3 mL水和3 mL甲醇淋洗后，以 5%甲酸甲醇5 mL溶液洗脱，收集洗脱液于30℃水浴中氮吹至干，加入1.0 mL的10%乙腈溶液溶解并混匀，过0.22 μm PTFE滤膜后UHPLC/MS/MS测试。
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化
吸取100 μL混合中间液，以50%乙腈稀释得到200 ng/mL的混合标准溶液，先进行Q1母离子扫描，得到11种头孢化合的的母离子[M+H]+，再进行碎片离子扫描Q2获得相应的碎片离子，选取丰度最高产物离子作为定量离子，次高的作为定性离子，最后进行MRM优化每个离子对的去簇电压和碰撞能，优化后的参数见表1。
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 色谱柱的优化
对比了常用的BEH C18和 HSS T3 两种色谱柱对11种头孢类化合物的分离效果。发现强极性化合物去乙酰基头孢在HSS T3色谱柱中具有更强的保留，而在BEH C18 几乎不保留，且多数头孢菌素化合物的峰形也更尖锐，分离度也更好，因此采用 HSS T3作为色谱柱。
2.2.2 流动相的优化
分别对比了水（含0.1%甲酸）-甲醇、水（含0.1%甲酸）-乙腈、0.02 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）- 甲醇、0.02 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）- 乙腈4种流动相的效果。结果显示，采用甲醇作为有机相时，多数头孢菌素的响应更好；当含有乙酸铵时，头孢菌素化合物的峰更窄且更尖锐，分离度也更好。因此，选择0.02 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）- 甲醇作为流动相体系，再进行梯度洗脱优化，11种头孢菌素化合物的总流离子图见图1。
图1 11 种头孢菌素的总流离子色谱图 ( 10 ng/mL)
Fig.1 Total flow ion chromatogram of 11 kinds of compounds
注：1~11分别是：去乙酰基头孢匹林、头孢匹林、头孢喹肟、头孢氨苄、头孢拉定、头孢洛宁、头孢乙腈、头孢噻肟、头孢唑林、头孢哌酮、头孢噻呋
2.3 前处理条件的优化
2.3.1 提取溶剂的选择
文献报道的提取溶剂主要为乙腈-水溶液。因此，本实验选择阴性鸡蛋样品进行2.0 μg/kg的加标回收实验，对比了50%乙腈水（v：v）~ 90%乙腈水（v：v）作为提取溶剂的效果。结果发现随着提取液中水相比例的增大，头孢菌素的回收率也逐渐提高，当水相比例达到40%时，11种头孢菌素的回收率达到高点，回收率为85.6% ~ 95.8%之间；而当水相超过40%时，回收率反而有所下降，这是由于当水相高于40%时，乙腈沉淀蛋白的能力降低，所得的提取液也更浑浊，基质效应增强导致回收率下降，最终选择60%乙腈作为提取溶剂。
2.3.2 净化方式的选择
由于鸡蛋样品中含有大量的脂肪、磷脂等杂质，需尽量除去以减少对仪器的污染以及降低基质效应。因此，选用阴性鸡蛋为基质，分别进行2.0 μg/kg的加标回收实验，对比了C18、HLB、MAX三种净化小柱对结果的影响。结果显示采用C18和HLB小柱净化时，7/11（63.6%）化合物的平均回收率在50%以下，这是由于提取溶剂为60%的乙腈，而头孢菌素极性均较强，无法在C18和HLB小柱上保留；而采用MAX小柱时，11种头孢菌素的平均回收率均在80%以上，这是由于头孢菌素类化合物大部分含有羧基，呈弱酸性，而MAX除了具有阴离子交换作用，还具有HLB和C18小柱的反向吸附功能。因此，最终选择MAX小柱作为净化柱。
2.5 方法学评价
2.5.1 线性范围、检出限和定量限
以头孢菌素的峰面积为Y轴，浓度为X轴进行线性回归，发现11种目标物在0.5 ~ 50.0 ng/mL浓度范围具有较好的线性关系，相关系数R2＞0.99。以3倍信噪比对应的浓度为检出限、10倍信噪比对应的浓度为定量限，11种头孢化合物在的检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg（结果见表2），说明该方法具有较高的灵敏度。
表2 11种头孢菌素的线性方程、检出限和定量限
Table 2 Calibration curves, limit of detection, f limit of quantification of 11 Analytes
序号 | 化合物 | 回归方程 | R2 | 检出限，μg/kg | 定量限，μg/kg |
1 | 头孢氨苄 | Y=5.7644e4+1.2342e4 | 0.9995 | 0.2 | 0.5 |
2 | 头孢拉定 | Y=1.1862e4-1.3538e3 | 0.9991 | 0.2 | 0.5 |
3 | 头孢唑林 | Y=2.1321e4+1.1542e4 | 0.9997 | 0.2 | 0.5 |
4 | 头孢哌酮 | Y=6.1143e3-2.1674e3 | 0.9992 | 0.2 | 0.5 |
5 | 头孢乙腈 | Y=3.02542e4-2.1466e4 | 0.9999 | 0.2 | 0.5 |
6 | 头孢匹林 | Y=3.02453e5+2.1044e4 | 0.9993 | 0.2 | 0.5 |
7 | 头孢洛宁 | Y=1.0221e5+2.4450e5 | 0.9994 | 0.2 | 0.5 |
8 | 头孢喹肟 | Y=4.1754e4+1.2547e4 | 0.9993 | 0.2 | 0.5 |
9 | 头孢噻肟 | Y=2.6784e5-1.1543e5 | 0.9996 | 0.2 | 0.5 |
10 | 去乙酰基头孢匹林 | Y=3.1454e4+1.8262e4 | 0.9993 | 0.2 | 0.5 |
11 | 头孢噻呋 | Y=2.1477e5+1.1322e5 | 0.9992 | 0.2 | 0.5 |
2.5.2 准确度与精密度
在阴性鸡蛋样品中进行1.00 μg/kg、2.00 μg/kg、10.0 μg/kg的加标回收试验，平行实验n=6。从表3可见，11种头孢化合物的平均回收率在81.7% ~ 97.1%之间， RSD在2.8% ~ 6.8%之间，说明开发的方法准确度与精密度均较好，说明该方法具有较好的准确度和精密度，可满足分析要求。
表3 准确度与精密度（n = 6）
Table 3 Recoveries and Precisions（n = 6）
化合物 | 加标水平，μg/kg | 平均回收率，% | RSDS，% | |
| ||||
头孢氨苄 | 1.00 | 83.6 | 3.5 |
|
2.00 | 82.1 | 4.1 |
| |
10.0 | 83.5 | 3.8 |
| |
头孢拉定 | 1.00 | 86.2 | 3.8 |
|
2.00 | 84.2 | 4.1 |
| |
10.0 | 83.2 | 5.3 |
| |
头孢唑林 | 1.00 | 85.7 | 5.5 |
|
2.00 | 81.7 | 3.9 |
| |
10.0 | 84.0 | 6.2 |
| |
头孢哌酮 | 1.00 | 93.2 | 5.9 |
|
2.00 | 96.1 | 4.8 |
| |
10.0 | 96.8 | 3.6 |
| |
头孢乙腈 | 1.00 | 84.2 | 4.6 |
|
2.00 | 83.2 | 5.9 |
| |
10.0 | 86.0 | 5.7 |
| |
头孢匹林 | 1.00 | 85.9 | 4.7 |
|
2.00 | 82.7 | 5.9 |
| |
10.0 | 81.9 | 6.2 |
| |
头孢洛宁 | 1.00 | 95.0 | 4.3 |
|
2.00 | 96.7 | 2.8 |
| |
10.0 | 93.4 | 3.6 |
| |
头孢喹肟 | 1.00 | 88.9 | 4.8 |
|
2.00 | 84.8 | 4.9 |
| |
10.0 | 86.9 | 4.1 |
| |
头孢噻肟 | 1.00 | 92.3 | 2.8 |
|
2.00 | 96.1 | 6.8 |
| |
10.0 | 94.4 | 5.5 |
| |
去乙酰基头孢匹林 | 1.00 | 95.1 | 6.0 |
|
2.00 | 93.8 | 4.6 |
| |
10.0 | 97.1 | 4.1 |
| |
头孢噻呋 | 1.00 | 95.4 | 5.3 |
|
2.00 | 95.6 | 6.5 |
| |
10.0 | 90.5 | 6.0 |
|
3 结 论
采用UHPLC-MS/MS结合MAX固相萃取技术建立了鸡蛋中11种头孢菌素含量的同步测定方法。在最优条件下进行方法验证，证明了建立的方法简单高效、灵敏度高、准确度和精密度好，适用于鸡蛋中头孢菌素的测定。
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