生化材料创新课程的实践与探索

刘娇娇^*

（常熟理工学院，江苏 常熟 215000）

摘 要：学科交叉能够培养学生的综合能力，提高教学效率。根据院系内的科研平台、教师背景、学科专业，考虑在学院内开展生化材料创新课程。本课程核心是通过脱水缩合反应得到了复合抗菌材料。材料的制备属于化工范畴，材料的应用属于生化范畴，材料的抗菌机制研究属于物理范畴，通过这种学科间深度交叉融合，希望培养出综合能力突出的高素质人才。

关键词：酰胺反应；抗菌肽；氧化石墨烯；复合抗菌材料；抗菌机制

中图分类号： O62 文献标识码：A

我国从八十年代开始，就有学者开始跨学科研究，目的是为了培养综合性人才。有机化学是化学、化工、药学专业的专业基础课，也是材料化学、物理学、生物化学、药物化学等众多专业的基础课程^[1,2]。基于此，学好有机化学基本理论知识，对于拓展知识范围、增强创新能力和促进学生高素质全面发展起到积极的作用。化学、物理化学、高分子材料、生物化学、环境保护、农业都会用到有机化学。因此掌握有机化学实验是非常重要的。我们在创新课程中，以有机化学制备材料为基础，制备出了抗菌效率高的抗菌材料，通过研究抗菌材料的抗菌性能，希望能够找到设计高效、低毒新型抗菌试剂的方法。在创新课程中，通过生物、化学、物理多学科的交叉融合，希望能够培养出综合素质高的高素质才人。

抗菌肽（AMPs）多数是由氨基酸残基构成，具有广谱抗菌活性，是高等生物免疫系统中必不可少的一环，主要存在于植物、昆虫及人类细胞中，可作为免疫反应或直接抗感染剂的先天调节剂^[3]。抗菌肽多为具有良好抗菌活性的天然多肽，因其独特的抗菌机制，可有效地杀灭一些耐药性病原体而备受关注。因此，抗菌肽是一种极具潜力的新型抗菌试剂。蜂毒肽（melittin）是抗菌肽的一种，是由26个氨基酸组成的阳离子肽^[4]，其有效的抗菌活性甚至能杀伤肿瘤细胞、破坏HPV^[5]。抗菌肽由于其独特的抗菌机制有望成为新型抗菌药物。但抗菌肽在血清、蛋白水解酶存在时稳定性、抗菌活性都会受到影响，这些因素限制了抗菌肽的临床应用^[6]。随着抗生素耐药性问题的出现，医学界迫切需要寻找新的抗菌试剂。很多研究表明：将金属粒子和抗生素连接，协同抗菌，可以提高抗生素的抗菌活性^[7,8,9]。这为本次创新课程中的实验材料的制备提供了思路。

石墨烯家族材料（例如 GO）是一种新的生物相容性材料，它高的比表面积允许表面高密度的功能化修饰，可以作为药物载体。因为石墨烯材料的二维结构，单片的石墨烯两侧都可以修饰其他物质，也可以进行表面功能化或者吸附在另外的基底上，共价键或者非共价键作用都可以用来连接其他物质到石墨烯表面，这样提高了氧化石墨烯生物相容性及稳定性。

本次课程的核心是基于协同抗菌的思想，设计了氧化石墨烯表面的羧基与蜂毒肽尾链的氨基发生酰胺化反应，用到的是氧化石墨烯量子点，尺寸约为39 nm，表面作了羧基改性，得到了GOQDs@melittin复合抗菌材料，并做了复合材料的表征测试，来判断GOQDs@melittin复合物的形成。然后通过模型细胞膜（内部包裹该黄绿素的单层巨囊泡GUVs）与抗菌材料作用，研究复合材料的抗菌机制，最后测试了复合材料的抗菌性能，发现复合材料的抗菌性能比纯蜂毒肽高。

在我们学校的理论教学、实验教学课堂中，仅仅是宣讲了该专业学科的理论知识与相关实验操作，这种模式很难培养学生的综合素质。通过生材料创新课程的开展，能够让学生学习到材料的设计与制备、材料的应用、机制的研究等多学科的知识，提升学生的科研素养和综合能力。

1 实验目的

（1）熟悉溶液中氨基和羧基的脱水缩合反应的方法。

（2）了解化合物常见的表征方法，了解相关表征仪器的样品制备过程、原理。

（3）复合抗菌材料的抗菌机制、抗菌效率研究。

（4）了解学科间的交叉综合。

2 实验原理

羧基改性的氧化石墨烯纳米点(GOQDs)，与蜂毒肽表面的氨基脱水缩合反应得到melittin@GO复合物；melittin与GO协同抗菌提高了melittin的抗菌效率。

3 仪器、试剂及表征手段

3.1 仪器与试剂

1, 2-二油酰-甘油-3-磷酸酰胆碱（DOPC）、罗丹明标记的1, 2-二棕榈酰-甘油-3-磷酸酰乙醇胺（RhB-PE），蜂毒肽(melititn)， 膦酰基乙酸三乙酯缓冲液(TEPA)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC），N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，恒温摇床，羧基改性的氧化石墨烯纳米点(GOQD)，烧杯，玻璃瓶，磁力搅拌器，透析袋（MW 3500），动态光散射(DLS)，酶标仪，原子力显微镜，透射电子显微镜，扫描电子显微镜，傅里叶变换红外光谱仪，CO₂培养箱，细菌培养液，96孔板，移液枪。激光扫描共聚焦显微镜（LSM，710 德国Zeiss），钙黄绿素（Calcein）

3.2 表征方法

3.2.1 动态光散射(DLS）

本次实验中用到的GOQDs、GOQDs@melittin的尺寸用动态光散射(DLS）来测量，用到的仪器型号为 Malvern Zetasizer Nano ZS90, UK。

3.2.2 原子力显微镜(AFM)

用型号为Asylum Research MFP-3D-SA的AFM（液相轻敲模式扫描）测量GOQDs、GOQDs@melittin的尺寸及厚度、表面形貌。AFM的关键技术是将微笑探针安装在微悬臂一端，通过探针与样品表面发生接触，激光打在探针上，探针在样品表面运动，激光的反射光束随之偏转并记录下样品的表面轮廓。

3.2.3 透射电子显微镜(TEM)

用TEM对GOQDs、GOQDs@melittin材料的微观成像性能进行研究。实验中用到的TEM的型号为 Hitachi HT7700，日本产。其基本原理是用非常细的高能入射电子作为光源轰击样品表面，在样品表面产生二次电子，从而获得样品放大的显微形态。

3.2.4 傅里叶变换红外光谱(FTIR)

傅里叶变换红外光谱仪基于物质对红外光谱的吸收，用来表征材料的分子结构和化学键等信息。GOQDs@melittin复合材料的表征中就用到了型号为(Thermo, Nicolet 6700)傅里叶红外光谱仪。

3.2.5 酶标仪

酶标仪本质上是一台分光光度计，通过测量细菌+药物溶液吸光度的方法，将得到的信号进行处理计算，得到最终的吸光度数值，通过计算可以得出细菌的存活率，得到药物对细菌的最小抑菌浓度。

3.2.6 激光扫描共聚焦显微镜（LSM）

LSM的原理是激光作为光源，用激光点扫描样品，并通过光源和探测器前的针孔，如若两个针孔尺寸一致，则与焦平面上光点形成共轭，即所谓的共聚焦，这样就只能探测到焦平面上的光点，焦平面上的光点则不能成像，提高了显微镜的分辨率

4 实验步骤

4.1 氨基羧基脱水缩合反应-酰胺反应

抗菌肽melittin 1mg，加入5 mM的TEPA 缓冲溶液1mL；然后加入 50 mM EDC 1uL，100 mM NHS 1uL， 其中EDC, NHS需要现配现用。室温20度以内，250 rpm摇晃10 h。melittin与GOs以8：1的比例加入量子点，室温20℃以内，250 rpm摇晃2 h，获得的复合物透析(MW 3500)以除去过量的肽，并浓缩到所需要浓度进一步实验。

4.2 GOQDs@melittin复合物的的应用-抗菌测试

在96孔板中加入100 L肉汤，然后将GOQDs、GO@Melittin梯度混合至8、16、32、64、128 ug/mL。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌配到最终浓度为10⁵ CFU/mL，并向每个孔中添加100 uL，使原药物浓度减半(从128 g/mL到4 g/mL)。多粘菌素作为大肠杆菌的对照药物，夫西地酸作为金球菌中的对照药物。使用封口膜将孔板密封住，在37℃的细菌培养箱培养12-16 h。用酶标仪读取各孔的吸光值，MIC值记录为杀死90 %细菌的最低浓度。所有MIC测量值均为三次以上独立实验的平均值。

5 实验结果分析

5.1 GOQDs@melititn复合材料的表征

从图1GOQDs、 GOQDs@melititn复合材料的DLS图中可以看到，GOQDs的尺寸为39±10 nm。经过蜂毒素修饰后，GOQDs颗粒的尺寸增大了大约为125 nm，大于纯GOQDs的尺寸。这可能是因为GOQDs与melititn发生了反应，形成了复合物导致尺寸增大。

约为3.2 nm，通过计算为4~5层。Melittin与GOQDs连接后，材料的高度值发生强烈偏差，可能是由于石墨烯表面修饰上了蜂毒肽。通过X透射衍射检测了本文所用到的石墨烯量子点，发现其是层状结构，通过计算得到层间距为8.5 Å。根据在液体中测量的AFM图像（图2所示），得到GOQDs的厚度约为3.2 nm，通过计算为4~5层。Melittin与GOQDs连接后，材料的高度值发生强烈偏差，可能是由于石墨烯表面修饰上了蜂毒肽。

图1 GO分散液的DLS表征图

Fig.1 DLS of the GO dispersion

图2 GOQDs、GOQDs@melittin的原子力显微镜表征图

Fig 2 TEM images of GOQDs、GOQDs@melittin

从图3的TEM图中可以看出，GOQDs@melittin的尺寸比GOQDs大，且GOQDs@melittin表面更圆滑，GOQDs表面不规则，局部会有突出的尖端。从材料的表面形貌可以看出GOQDs与melittin连接形成了复合物。

图3 GOQDs、GOQDs@melittin的TEM图像

Fig 3 TEM images of GOQDs、GOQDs@melittin

从图4红外图谱中可以看出，GOQDs@melittin，melittin两种材料在 3423 cm ^-1 处有较强的吸收，这是氨基上的-NH 伸缩振的结果^[10]，在 1655 cm ^-1 左右强的吸收峰是酰胺键的特征吸收峰，melittin中酰胺键特征吸收峰在1655 cm ^-1，而GOQDs@melittin的酰胺键的特征吸收峰为1641 cm ^-1，与纯melititn有所偏移，这可能是GOQDs的羧基与氨基脱水缩合形成的酰胺键与氨基酸内部脱水缩合形成的酰胺键会有一些区别导致的。

图4 GOQDs@melittin、melittin的红外光谱图

Fig 4 Infrared spectrogram of GOQDs@melittin、melittin

5.2 GOQDs@melittin复合材料的应用-抗菌测试及表征

为了测试GOQDs@melititn的抗菌效果，我们分别测量了GOQDs@melititn对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E. coli) 和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S. aureus) 的最低抑菌浓度MIC。蜂毒肽、 GOQDs、 多粘菌素（一种抗生素，作用于大肠杆菌） 和夫西地酸（一种抗生素，作用于金黄色葡萄球菌）的抑菌情况作为对照。如图5A所示。GOQDs@ melittin的MIC值分别为1.2 µg/mL （大肠杆菌）和 5.0 µg/mL（金黄色葡萄球菌）；而蜂毒肽的MIC值分别为 25.0 µg/mL 和 45.0 µg/mL，对比与蜂毒肽，表明 GOQDs@ melititn的抗菌能力相比于抗菌肽得到了大幅度提高。用扫描电子显微镜（SEM）观察了GOQDs@ melititn与细菌作用前后的形态变化，发现加入GOQDs@ melititn后细菌膜表面会出现明显的损伤和坍塌现象（如图 5 B 所示，黄色箭头所指处所示）。这说明 GOQDs@ melittin对细胞膜具有很强的破坏性。这些结果都表明GOQDs@melititn复合材料较melititn有更高的抗菌效率。间接证明了GOQDs与melititn形成了复合材料。

图5 （A）Melltin@GO复合物MIC测试（B） Melltin@GO复合物与细菌作用前后的SEM图像

Fig 5 (A) MIC distribution of the Melittin@GO complexes toward E. coli and S. aureus.( B ) SEM images of E. coli and S. aureus bacteria before or after Melltin@GO treatment.

5.3纳米杂化材料与细胞膜作用方式的测量（抗菌的机制）

图6 GOs@melittin与囊泡作用的共聚焦表征图

Fig 6 The Confocal images of Melittin@GO interaction with GUVs@Calcein

GO@melittin复合结构能够插入细胞膜是它具有高效抗菌能力的基础。为了验证这一点，用单层巨囊泡GUV作为细胞膜模型。将不同浓度的纯melittin，GOQDs @ mellitin加入到包裹有钙黄绿素的 GUV 溶液中（如图6（A）-（C）所示）， 然后通过共聚焦显微镜观察发现，低浓度的 GO @ mellitin 加入囊泡中会立刻发生钙黄绿素泄漏， 但GUV 形貌保持完整。说明加入melittin后会在 单层巨囊泡的磷脂膜上形成了孔，造成了钙黄绿素的泄露。而对于纯melittin而言，加入melittin（0.35 ×10^-6 M）至少二十分钟才能观测到。 GO @ mellitin，melittin两种材料在临界成孔浓度上存在很大差异，且GO @ mellitin的临界成孔浓度明显更小，表明GO @ mellitin复合物成孔能力更强。另外， GOQDs @ melittin 与囊泡相互作用过程中GOQDs @ mellitin与膜存在共定位现象（6（C）），表明GOQDs @ mellitin确实可能是通过插入的方式进入细胞膜中。

6 结论

本实验通过简单的脱水缩合反应制备了GOQDs@melittin复合材料。得到以下结论：

（1）DLS、AFM、TEM、红外光谱证明了GOQDs@melititn复合材料的成功制备。

（2）抗菌测试结果显示GOQDs@ melittin作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为1.2 µg/mL 和 5.0 µg/mL； 而蜂毒肽的MIC值分别为 25.0 µg/mL 和 45.0 µg/mL, 这表明GOQDs@melititn复合材料的抗菌效率较melititn高，这也间接证明了GOQDs与melititn形成了复合物。

（3）GOQDs@ melittin复合材料通过插入的方式进入细胞膜中，表明GO与melittin可能是通过协同作用，发挥抗菌作用，为我们设计高效低毒的新型抗菌试剂提供可能性。

7 课程建议

生化材料创新课程本学院本科生开展，可以帮助学生更好的理论知识，提高动手、查阅文献资料的能力，还能够提高学生的科研兴趣。旨在培养出高素质综合性人才。

该创新型课程建议安排12课时，创新包括前期的查阅文献撰写预习报告，实验中的常规操作，基本问题的分析，表征测试结果的分析，最后引导通过知网、万方、维普等数据库查阅一些文献资料，结合实验结果撰写科技论文。科技论文中需要介绍氧化石墨烯、抗菌肽材料的研究现状，抗抗菌肽抗菌效率提高的方法，抗菌肽表面修饰后材料的表征方法等内容。在创新课程中作为老师，要引导学生主动思考、分析问题，达到理解所学知识的目的。例如，在氨基与羧基的缩合反应中，为什么melittin与GOs的比例为8：1，为什么该反应要在室温下进行。同时也要演示表征仪器的使用、原理及注意事项，对于表征的结果也要引导学生学会自己分析。

在该创新课程中，在加深学生对相关理论知识理解的同时，还能优化、丰富实验教学的内容。将科研成果与创新课程相结合，能够提高学生对专业课程的学习兴趣。本次创新课程内容丰富，涉及到多门学科的交叉融合，能够充分锻炼学生的动手能力及创新思维。此外，整个表征过程可以培养学生操作仪器设备的能力，抗菌测试能够引导学生将专业知识用到科研实验中，开拓学生的创新思维。

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