人们精神长期处于高压状态和作息不规律易使人体免疫功能下降，会导致身体各器官的功能下降，影响身体正常的新陈代谢。免疫力下降会增加自身免疫性疾病的风险，从而导致自身免疫性疾病。研究发现，免疫细胞数量的显著变化会导致免疫系统随之变化[1]。为了满足机体需要，有必要开发新的相关产品来改善免疫功能。
参玫五味颗粒剂是由刺玫果、人参、黄芪、女贞子和枸杞子制备的保健食品。其中人参[2]是五加科植物人参的干燥根，可多层次增强免疫功能[3]。文献资料表明，人参水煎剂对模型小鼠的脾指数、脾细胞活性的影响，证实人参皂苷等成分对免疫器官具有保护和促进作用[4]。人参皂苷与黄芪、女贞子配伍使用具有调节免疫功能、增强抗氧化性等多种生物活性[5-7]。刺玫果是蔷薇科属植物山刺玫的成熟果实[7]，含有丰富的维生素和膳食纤维[9]，与人参、黄芪配伍使用，可以增强机体免疫系统及双向调节血糖作用[10-11]。枸杞子与女贞子同具有养血明目、补肾益精之功效[12-13]。皂苷提取的主要方法有水磨醇提、超声辅助提取法、酶解提取法、亚临界提取法[14]等，提取时应控制温度防止物质结构被破坏，或超声波时长问题，导致其他物质的溶出影响皂苷所得率发生改变[15]。本文利用醇提法提取参玫五味总皂苷，与其他方式相比，醇提可以简便快捷的将总皂苷从原料中分离出来，并且原料的利用率较高。本试验采用了香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法[14]测定其总皂苷含量，以总皂苷含量为考察指标，通过单因素实验及正交实验，考察参玫五味总皂苷的最优提取工艺参数，并探索了参玫五味颗粒体外降糖和清除DPPH自由基的活性，为其进一步研究及开发提供基础数据，为食品及医药产业发展提供思路。
1材料与方法
1.1
材料与试剂
刺玫果：安徽亳州医药材料总公司；人参、黄芪、女贞子、枸杞子：吉林国安药业有限公司；人参皂苷Re对照品：成都曼思特生物科技有限公司；抗坏血酸：天津市永大化学试剂有限公司；香草醛：天津市光复精细化工研究所；乙醇、冰醋酸、无水甲醇、浓硫酸、高氯酸均为分析纯，天津市北方天医化学试剂有限公司。
1.2
仪器与设备
紫外分光光度计（TU-1950）：北京普析通用仪器有限责任公司；台式高速离心机（H1850）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；酶标仪（PL-9602）：北京普朗新科技有限公司。
1.3
实验方法
1.3.1 原料的预处理
刺玫果、人参、黄芪、女贞子、枸杞子，恒温（≤70℃）干燥，分别粉碎，过80目筛，按处方量混合得到参玫五味药粉。
1.3.2 参玫五味总皂苷的提取工艺优化
1.3.2.1总皂苷的含量测定
精密移取不同浓度梯度的人参皂苷Re对照品溶液，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法[14]，在560 nm
处测定，以人参皂苷Re质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制其标准曲线为y=11.109x-0.0288（R2=0.9995），表明在人参皂苷Re在6.67~80.00（μg/mL）内线性关系良好。
吸取供试品溶液适量，按照人参皂苷Re标准曲线的绘制方法进行显色，以不加显色剂的供试品溶液为空白对照，在560 nm处测定其吸光度，根据线性方程计算供试品溶液中总皂苷质量，得出总皂苷提取率，计算公式如下：
总皂苷提取率（mg/g）＝
式中：
1.3.2.2总皂苷提取工艺的正交实验
前期对参玫五味总皂苷提取方式、提取溶剂种类、原料吸收溶剂量进行了探索，实验结果表明参玫五味总皂苷以醇提为优、提取溶剂为乙醇水溶液、原料吸收溶剂量为1.5倍，最小浸没原料溶剂量为5.3倍。在上述实验的基础上，参玫五味总皂苷的提取影响比重较大的因素有提取次数、料液比、提取时间和乙醇体积分数等，故采用四因素三水平正交实验优化提取工艺参数[17]。正交因素表见表1。
表1 正交因素水平表
Table1 Orthogonal factor level table
|
水平 |
因素factors |
|
||||
|
A提取次数/次 |
B料液比/（g:mL） |
C提取时间/h |
D乙醇体积分数/% |
|||
|
1 |
1 |
1:6 |
1.5 |
50 |
|
|
2 |
2 |
1:8 |
2.0 |
60 |
|
|
3 |
3 |
1:10 |
2.5 |
70 |
|
1.3.2.3提取工艺验证实验
取参玫五味药粉适量，按照最佳提取工艺条件进行提取、过滤、浓缩，将浓缩液置于真空干燥箱干燥至恒重，计算出膏率和总皂苷的提取率。
1.3.3 参玫五味颗粒剂的制备工艺研究
1.3.3.1单因素实验
按照最佳提取工艺制备成干浸膏，以参玫五味干浸膏粉为原料，分析辅料、稀释剂配比、矫味剂种类、矫味剂用量、润湿剂种类、稀释剂用量对参玫五味颗粒剂的影响。
1.3.3.2参玫五味颗粒剂制备工艺的正交实验
考察浸膏粉与稀释剂的比例、润湿剂乙醇的体积分数、乳糖与糊精的比例对颗粒剂制备的影响。采用正交实验对参玫五味颗粒剂的制备工艺参数进行优化[17]。正交因素表见表2。
表2 正交因素水平表
Table2 Orthogonal factor level table
|
因素factors |
||||||
|
水平 |
A 浸膏粉:稀释剂/（g:g） |
B 润湿剂乙醇的体积分数/% |
C 乳糖:糊精/（g:g） |
|||
|
1 |
1:3 |
80 |
1:1 |
|||
|
2 |
2:1 |
85 |
1.5:1 |
|||
|
3 |
3:1 |
90 |
2:1 |
|||
1.3.4 参玫五味颗粒提取物的体外活性研究
1.3.4.1参玫五味颗粒提取物的体外降血糖活性研究
称取参玫五味颗粒提取物适量，加入PBS溶液配制成不同质量浓度的样品溶液，按照文献[20]的方法在405 nm处，使用酶标仪测吸光度Ai、Az、As；按式计算参玫五味颗粒提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率。
Ai为不同样品溶液与PBS、4-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷（4-Nitrophenyl α-D-galactopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶溶液以及Na2CO3溶液反应后吸光度值；Az为PBS溶液代替样品溶液与上述溶液反应后吸光度值；As为PBS溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液与上述溶液反应后吸光度值。
1.3.4.2参玫五味颗粒提取物清除DPPH自由基实验
参照文献[21]的方法，取2.0 mL不同质量浓度样品溶液与2.0 mL DPPH自由基溶液（0.2 mmol/L）进行避光反应，反应完全后，以60%乙醇为参比溶液在517 nm处测定Ai、Az、As，同上述操作，按式计算DPPH自由基的清除率。
式中，Ai是不同浓度样品溶液与DPPH自由基溶液反应后的吸光度值；Az是蒸馏水2.0 mL代替样品溶液测定吸光度值；As是无水乙醇2.0 mL代替DPPH自由基溶液测定吸光度值。
2结果与分析
2.1 参玫五味总皂苷提取工艺的实验结果
2.1.1正交实验结果
正交实验结果见表3。由正交实验结果表3可知，RD＞RA＞RC＞RB，即各因素对总皂苷提取率的影响作用次序为D>A＞C＞B，A因素中 K3＞K2＞K1，提取次数2与3相差2.1%，考虑到成本问题，优选A2；B因素中K3＞K1＞K2，料液比优选B3；C因素与D因素中均K3＞K2＞K1，提取时间优选C3，乙醇浓度优选D3；最终经过综合考虑，确定最佳工艺条件为A2B3C3D3，即煎煮2次，料液比1:10，时长2.5 h，乙醇浓度70%。
|
表3 提取工艺正交实验结果分析表 Table 3 Analysis table of orthogonal experimental
results of extraction process |
|||||
|
序号 |
A提取 次数/次 |
B料液比/ （g:mL） |
C提取时间 /h |
D乙醇体积分数 /% |
提取率/（mg/g） |
|
1 |
1 |
1:6 |
1.5 |
50 |
3.17 |
|
2 |
1 |
1:8 |
2 |
60 |
4.89 |
|
3 |
1 |
1:10 |
2.5 |
70 |
6.62 |
|
4 |
2 |
1:6 |
2 |
70 |
6.07 |
|
5 |
2 |
1:8 |
2.5 |
50 |
4.67 |
|
6 |
2 |
1:10 |
1.5 |
60 |
6.29 |
|
7 |
3 |
1:6 |
2.5 |
60 |
6.43 |
|
8 |
3 |
1:8 |
1.5 |
70 |
6.15 |
|
9 |
3 |
1:10 |
2 |
50 |
4.77 |
|
K1 |
4.89 |
5.22 |
5.2 |
4.2 |
|
|
K2 |
5.68 |
5.24 |
5.24 |
5.87 |
|
|
K3 |
5.78 |
5.89 |
5.91 |
6.28 |
|
|
R |
0.89 |
0.67 |
0.71 |
2.08 |
|
2.1.2提取工艺实验验证结果
称取适量参玫五味药粉，按照最佳提取工艺平行提取3次，参玫五味药粉的出膏率分别是35.71%、35.37%、35.27%，平均出膏率为35.45%。总皂苷提取率分别为7.37、7.30、7.41 mg/g，平均值为7.36 mg/g，RSD值为0.76%，表明该提取工艺稳定、可行。
2.2 参玫五味颗粒剂制备工艺实验结果
2.2.1单因素实验结果
2.2.1.1辅料初步选择的实验结果
辅料吸湿率结果见表4。结果显示，乳糖与糊精的吸湿性数值相近，单选一种作为辅料，含量测定时不宜提取完全，因此选用乳糖与糊精为辅料。
表4 各辅料吸湿率
Table 4 Hygroscopic rates of each accesory
|
辅料 种类 |
4 h吸 湿率/% |
8 h吸湿 率/% |
12 h吸湿 率/% |
24 h吸湿 率/% |
48 h吸湿 率/% |
|
|
乳糖 |
1.34 |
2.43 |
3.17 |
5.22 |
11.72 |
|
|
可溶性淀粉 |
4.33 |
7.60 |
9.75 |
14.29 |
22.51 |
|
|
微晶纤维素 |
5.98 |
10.74 |
13.66 |
21.40 |
37.00 |
|
|
糊精 |
2.63 |
4.4 |
5.51 |
8.28 |
13.83 |
|
|
麦芽糊精 |
9.39 |
16.33 |
21.17 |
32.12 |
53.50 |
|
2.2.1.2稀释剂配比的选择结果
综合评分见表5。乳糖与糊精的不同配比结果中，休止角与吸湿率数值均趋近，溶化率均达到92%以上，乳糖与糊精的比例为2:1和3:1时，综合评分达到95分以上。考虑乳糖成本问题，以及稀释剂比例为2:1时成型率较高，选择稀释剂比例为2:1。
综合指标评分=
式中：X：吸湿率值，%；Z：休止角，°；C：成型率，%；R：溶化率，%。
表5 稀释剂配比的选择结果
Table 5 Result of selection of diluent ratio
|
乳糖:糊精（g:g） |
成型率/% |
休止角/° |
吸湿率/% |
溶化率/% |
综合评分 |
|
|
1:1 |
51.09 |
33.69 |
8.4 |
92.68 |
84.72 |
|
|
1:2 |
52.87 |
29.74 |
8.23 |
95.64 |
88.17 |
|
|
1:3 |
76.97 |
35.54 |
8.69 |
94.00 |
92.09 |
|
|
2:1 |
84.97 |
32.01 |
8.01 |
98.48 |
95.92 |
|
|
3:1 |
70.87 |
30.47 |
7.99 |
99.88 |
97.24 |
|
2.2.1.3 稀释剂用量的选择结果
浸膏粉与稀释剂的质量比1:1时，溶化率93.00%，综合评分97.05分，选用参玫五味干浸膏粉与稀释剂的比例为1:1。
2.2.1.4 矫味剂种类与用量的选择结果
选择三氯蔗糖、木糖醇、甘露醇三种矫味剂，以溶化率为考察标准进行矫味剂种类选择。结果显示，三氯蔗糖的溶化率85.61%，木糖醇的溶化率80.35%，甘露醇的溶化率82.17%。三氯蔗糖的溶化率较高，选用三氯蔗糖为矫味剂。矫味剂用量以原辅料总质量的0.2%时，溶化率85.19%。
2.2.1.5 润湿剂种类的选择结果
85%的乙醇溶液作为润湿剂时，成型率为85.97%，综合评分为97.89分。润湿剂用量：参玫五味干浸膏粉与稀释剂总质量：润湿剂体积（g:mL）=1:0.2。
2.2.2 参玫五味颗粒剂制备工艺的正交实验结果
参玫五味颗粒的正交实验结果见表6。结果显示，浸膏粉末和稀释剂比例对颗粒综合得分的影响最大，乳糖和糊精比例对颗粒综合得分有一定的影响，而湿润剂乙醇的体积分数对颗粒综合得分的影响最小，因为湿润剂酒精的体积分数较大，在实验和生产实践的基础上，选择了A2B1C2，即浸膏粉与稀释剂质量比为1:1（g:g），润湿剂为85%的乙醇水溶液，乳糖与糊精质量比为2:1（g:g）。
表6 制备工艺正交实验结果
Table 6 Prepare process orthogonal experimental
results
|
实验号 |
A |
B |
C |
成型率/% |
休止角 /° |
吸湿率 /% |
溶化率 /% |
综合 评分 |
|
1 |
1 |
1 |
1 |
81.23 |
35.67 |
10.53 |
84.88 |
85.40 |
|
2 |
1 |
2 |
2 |
84.20 |
34.56 |
11.71 |
86.24 |
89.50 |
|
3 |
1 |
3 |
3 |
79.28 |
34.56 |
11.94 |
95.96 |
89.93 |
|
4 |
2 |
1 |
3 |
81.16 |
35.53 |
12.55 |
84.96 |
90.52 |
|
5 |
2 |
2 |
1 |
88.46 |
32.01 |
13.00 |
87.22 |
95.22 |
|
6 |
2 |
3 |
2 |
90.38 |
32.01 |
13.48 |
88.28 |
96.78 |
|
7 |
3 |
1 |
2 |
89.50 |
30.47 |
10.26 |
89.84 |
92.17 |
|
8 |
3 |
2 |
3 |
89.31 |
34.56 |
9.79 |
90.88 |
88.56 |
|
9 |
3 |
3 |
1 |
90.45 |
34.56 |
10.05 |
86.76 |
88.28 |
|
K1j |
88.28 |
87.9 |
89.63 |
|
|
|
|
|
|
K2j |
92.71 |
91.09 |
92.82 |
|
|
|
|
|
|
K3j |
89.67 |
91.66 |
88.20 |
|
|
|
|
|
|
R |
4.43 |
3.76 |
4.62 |
|
|
|
|
|
|
Max |
92.71 |
91.66 |
92.82 |
|
|
|
|
|
2.2.3参玫五味颗粒剂制备工艺的工艺验证实验结果
按照参玫五味颗粒剂的最佳制备工艺制备3批颗粒剂，并进行相关质量检查。由实验结果可知，3 批工艺稳定性验证实验所得颗粒剂的平均成型率94.66%，RSD为0.54%；平均吸湿率为10.53%，RSD为3.17%；平均溶化率为89.68%，RSD为0.81%；平均休止角α为31.17°，RSD为2.24 %。结果表明颗粒剂的制备工艺可重复性较高，工艺稳定可靠。
2.2.4颗粒剂的质量检查
2.2.4.1 粒度检查
根据双筛分法[10]进行粒度检查，所得颗粒中不能通过一号筛的粗粒及能通过五号筛的药粉占总质量的7.13%，小于15%，符合中国药典的相关要求。
2.2.4.2 水分检查
采用硅胶真空干燥法，温度为80 ℃下进行真空干燥，4 h后称重，实验结果显示，颗粒剂中的水分为3.01%，符合中国药典的相关要求[24]。
2.2.4.3 含量测定
取颗粒剂1.0 g，放置于圆底烧瓶中，进行回流提取30 min，重复2次，抽滤，测定总皂苷质量，结果表明参玫五味颗粒剂中含总皂苷的含量为10.89（mg/g）。
2.3 参玫五味颗粒提取物体外活性的实验结果
2.3.1 α-葡萄糖苷酶活性抑制率的测定结果
以不同样品溶液为横坐标，IC50值为纵坐标绘制柱状图，结果见图1。随着参玫五味颗粒提取物中总皂苷及阿卡波糖质量浓度升高，抑制α-葡萄糖苷酶活性能力越强。参玫五味颗粒提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率的线性回归回归方程：y=9.1366x+9.001（R2=0.9750），IC50=6.46 μg/mL；阿卡波糖对对α-葡萄糖苷酶抑制率的线性回归方程：y =
2.4317x + 25.282（R² = 0.9302），IC50=10.16
mg/mL。由图1显示，参玫五味颗粒提取物的IC50远小于阿卡波糖，说明参玫五味颗粒提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力强于阿卡波糖。
图1 不同样品溶液对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用
Fig.1 Inhibition of α-glucosidase activity by
different sample solutions
2.3.2 DPPH 自由基清除率的测定结果
以不同样品溶液为横坐标，IC50值为纵坐标绘制柱状图，结果见图2。随着参玫五味颗粒提取物中总皂苷及维生素C质量浓度的升高，其对DPPH自由基的清除率不断增加，说明其抗氧化能力随着浓度的变化逐渐增强。参玫五味颗粒提取物对DPPH自由基的清除率的线性回归方程：y=122.0200x+12.0820（R2=0.9895），IC50=0.31
mg/mL；维生素C对DPPH自由基的清除率的线性回归方程：y = 1.3451x + 9.8325（R2 =
0.9923），IC50=0.029 mg/mL。由图2显示，参玫五味提取物对DPPH自由基的清除能力弱于维生素C。
图2 不同样品溶液对DPPH自由基清除作用
Fig.2 Different sample solutions on DPPH radical
scavenging
3结论
本实验探索了参玫五味总皂苷的提取工艺及颗粒剂的制备工艺，提取工艺的实验结果表明，参玫五味总皂苷的最佳提取工艺：70%乙醇溶液，料液比1:10，提取2次，时长2.5 h，在最佳提取工艺条件下，参玫五味总皂苷的的平均提取率为7.36 mg/g，平均出膏率为35.45%。颗粒剂的制备工艺实验结果表明，参玫五味颗粒剂的最佳制备工艺为：干浸膏粉与稀释剂质量比为1:1（g:g），稀释剂乳糖与糊精的质量比为2:1（g:g），三氯蔗糖为矫味剂，三氯蔗糖的用量为原辅料总质量的0.2%，润湿剂为85%乙醇溶液。体外活性实验结果表明，参玫五味颗粒提取物总皂苷随着质量浓度的升高抑制α-葡萄糖苷酶活性增强，参玫五味颗粒提取物的IC50值小于阿卡波糖，说明参玫五味颗粒剂具有较强的降血糖活性。参玫五味颗粒总皂苷随着质量浓度的升高清除DPPH自由基的能力不断升高，参玫五味颗粒提取物的IC50为0.31 mg/mL，说明参玫五味颗粒剂具有一定的抗氧化活性，实验结果为参玫五味制剂在食品、药品领域的进一步开发和应用提供了参考。
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