高效柴油降解菌的分离鉴定及降解性能研究

　　

高效柴油降解菌的分离鉴定及降解性能研究

陈应星 ¹，王建刚¹，陈长灏¹，周郭²，徐婷婷²

（ 西华师范大学 环境科学与工程学院，四川 南充 637000）

摘要：从柴油污染土壤中分离筛选出2株高效石油降解菌株CY-1和CY-2，经形态学观察、生理生化实验及16S rRNA基因序列分析，鉴定CY-1为多舌假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida），CY-2为土地戈登菌（Gordonia terrae）。进一步研究了2株高效菌降解柴油的最佳条件及其对烷烃各组分的降解性能。实验结果表明：培养温度30 ℃，pH 7.0，柴油浓度500 mg/L，接种量8%，NaCl浓度0.5%时，CY-1菌株培养7 d后对柴油的降解率达到65.51 %，对链长C15～C25烷烃的平均降解率达到65.36 %；培养温度30 ℃，初始pH 7.0、柴油浓度3000 mg/L，接种量2 %，NaCl浓度0.5 %时，CY-2菌株培养7 d后对柴油的降解率达到64.87 %，对链长为C15～C25的烷烃的平均降解率达到85.83 %。两株菌在柴油污染治理方面均具有一定的应用前景，两株菌相比，CY-2菌株降解柴油的性能优于CY-1菌株。

关键词：柴油；菌种鉴定；生物降解；降解特性

Isolation, identification and degradation characteristics of high efficiency diesel degrading bacteria

CHEN Yingxing¹，WANG Jiangang^1*，CHEN Changhao¹，ZHOU Guo²，XU Tingting²

College of Environmental Science and Engineering, West China Normal University, Nanchong 637000, China

Abstract: Two highly efficient petroleum-degrading strains, CY-1 and CY-2, were isolated and screened from soil contaminated with diesel fuel. Following morphological observation, physiological and biochemical experiments, as well as 16S rRNA gene sequence analysis, CY-1 was identified as Pseudomonas plecoglossicida while CY-2 was identified as Gordonia terrae. The optimal conditions for the degradation of diesel oil by these two high-efficiency bacteria strains and their metabolism of straight-chain alkanes were investigated. Experimental results demonstrated that at a culture temperature of 30°C, pH of 7.0, diesel oil concentration of 500 mg/L, inoculation amount of 8%, and NaCl concentration of 0.5%, the degradation rate achieved by CY-1 reached 65.51% after a seven-day culture period with an average degradation rate for C15-C27 alkanes reaching 64.30%. Similarly, when cultured at a temperature of 30°C with an initial pH value of 7.0, a diesel oil concentration of 3000 mg/L, an inoculation amount of 2%, and a NaCl concentration also at 0.5%, the diesel oil degradation rate exhibited by strain CY-2 reached up to approximately 64 .87% after seven days with an average degradation rate for alkanes ranging from C14 to C27 reaching approximately87 .73%.Both strains have a certain application prospect in diesel pollution control, and the diesel oil degradation performance of CY-2 strain was better than that of CY-1 strain.

Key words: Diesel oil; Strain identification; Biodegradation; Degradation characteristics

柴油作为原油提炼后液态燃料之一，广泛用于交通和工业领域^[1]，它为人类提供便利的同时，也引起了严重的土壤和地下水污染问题。柴油主要组分包括烷烃、环烷烃、烯烃、芳香烃等^[2]，易于通过皮肤接触、呼吸系统被人体吸收，进而对人体各器官造成严重的损害^[3]，柴油组分中的多环芳烃具有极强的“三致效应”，更是被美国环境保护署列为优先控制污染物^[4]。因此，加大柴油污染土壤修复技术的研究一直是众多研究者关注的热点问题。目前，关于柴油污染土壤的修复方法主要有物理修复、化学氧化、生物降解及联合修复技术^[5]。物理和化学修复技术的优点在于修复速度快，但存在成本较高，易造成二次污染的问题，生物修复技术则因为修复成本低，对土壤的扰动性弱，环境友好型强等优点，正成为最具潜力的修复技之一^[6,7]，但是它的难点在于修复周期长，微生物对于一些重质石油烃组分的代谢能力较差，此外，中国气候的复杂性和土壤类型的多样性，都会影响污染物功能菌群的类型及其对污染物的降解性能^[8,9]。因此，筛选高效、广谱性强的柴油降解菌，利用外源菌提高土壤中柴油污染物的降解即成为生物修复技术的关键^[10]。

本文旨在从柴油污染土壤中分离筛选出高效的柴油降解菌株，研究其生长的最适环境条件及其对柴油和烷烃的降解性能，以期为柴油污染土壤生物修复提供菌源和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试柴油污染土壤

供试柴油污染土壤由采自西华师范大学校园表层0～20 cm，去除多余杂质，经研磨过2 mm筛的土壤制备获得。制备土样时，可将一定质量柴油溶于正己烷，待充分溶解后，再混拌于土壤中，经充分搅拌、混匀，使土壤中柴油污染物浓度为10%，待老化30 d后，于4 ℃冷藏备用。土壤理化性质为：含水率11.55 %，有机质12701.1 mg/kg，总氮416.1 mg/kg，pH 7.95。

1.1.2 实验试剂和培养基配置

柴油：市售0^#柴油（密度：0.839kg/L）。

无机盐液体培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 3.8 g、KH₂PO₄ 1 g、NaCl 5 g、NH₄Cl 0.1 g、MgSO₄ 0.2 g、蒸馏水1 L，pH 7.0。

无机盐固体培养基：无机盐液体培养基1 L、琼脂15 g。

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1 L，pH 7.0。固体培养基应加入15.0 g 琼脂。

柴油降解培养基：无机盐液体培养基1 L、0^#柴油0.5 g。

所用的培养基均需在 121 ℃下高温灭菌 30 min后使用，所用试剂均为分析纯^[11]。

1.2 实验方法

1.2.1 降解菌的富集和筛选

称取10 g柴油污染土壤于90 mL灭菌后无机盐液体培养基中，再加入一定量柴油后，置于30 ℃摇床内，以160 r/min震荡培养^[12]。富集7 d后以10 % 的接种量转接至新鲜无机盐液体培养基继续震荡7 d，逐步提高柴油浓度，经富集驯化4代后，移取1 mL富集菌液梯度稀释，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上涂布、划线分离、纯化得到单菌^[13]。将纯化三次后的单菌接种于柴油无机盐固体培养基上，置于30℃恒温培养箱中倒置培养，定期观察生长情况。再用接种环挑取生长较好的菌种分别接入牛肉膏蛋白胨培养基中富集培养，制备菌悬液，使菌悬液OD₆₀₀ 值为1.0（细菌个数1×10⁸ CFU/mL）^[14]，随后分别接种于柴油降解培养基中，进行菌株降解柴油实验。

1.2.2 菌株生理生化实验和分子生物学鉴定

降解菌株生理生化实验参照《常见细菌系统鉴定手册》进行^[15]。菌株分子生物学鉴定通过测定细菌16S rRNA序列并在NCBI中进行BLAST比对后确定，使用MEGA11.0软件，构建菌株系统发育树。

1.2.3 菌株的生长曲线测定

菌株生长曲线测定采用分光光度法进行。将降解菌株以5 %的接种量接种于200 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃，160 r/min条件下连续震荡培养，每4 h 取9 mL培养液放入10 mL离心管中，以4000 r/min 离心10 min后去除上清液，再用无菌水吹打沉淀至重悬，定容至9 mL 后再次离心。重复上述步骤两次后，用分光光度计测定菌悬液在OD₆₀₀处的吸光度^[16]。

1.2.4 高效柴油降解菌降解特性研究

菌株降解柴油实验分别研究了温度（15、20、25、30、35 ℃）、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、接种量（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL）、NaCl含量（0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %、2.5 %）及柴油浓度（500、1000、3000、5000、7000 mg/L）对菌株降解柴油的影响。实验时，将分离获得的目标菌株接种于装有100 mL 柴油降解培养基的锥形瓶中，于30 ℃，160 r/min摇床培养7 d，然后，通过液-液萃取法测定石油柴油降解率^[17]。

1.2.5 GC分析

样品提取：取待测样品25 mL于100 mL分液漏斗中，用20 mL正己烷萃取，保留有机相，重复萃取2次。合并萃取液，将萃取液用无水硫酸钠脱水，再将萃取液进行浓缩，定容至1 mL。

气相色谱条件（型号：GC-112A，上海仪电分析有限公司）：分流进样，色谱柱为石英毛细管色谱柱（30 m ×0.25 mm ×0.25 μm ），进样口温度280 ℃，检测器温度300℃，进样量1 μL，氢气流量35 mL/min，尾吹气流量20 mL/min，空气流量300 mL/min，升温60℃保持1 min后，以8 ℃/min升至290 ℃，再以30 ℃/min升至320 ℃ 保持12 min^[18]。

2 结果与分析

2.1 柴油降解菌的筛选和鉴定

2.1.1 高效降解菌的形态和生理生化特征

通过在培养基中富集、驯化，最终分离筛选出2株高效降解菌CY-1和CY-2。如图1（a）所示，CY-1菌株菌落形状为圆形，菌落大小0.8 ~ 1.5 mm，表面湿润光滑，颜色为白色，边缘整齐，菌落生长前期为点状，随着培养时间增加变成饼状；如图1（b）所示，CY-2菌株菌落形状为圆形，菌落大小0.2 ~ 0.4 mm，表面干燥凸起，颜色为橙红色，边缘整齐。两株菌落生理生化特征如表1所示，可以看出CY-1菌株为好氧革兰氏阴性菌，CY-2菌株为好氧革兰氏阳性菌。

(a)CY-1菌落形态 (b)CY-2菌落形态

图 1 CY-1和CY-2 菌株菌落形态

Fig.1 CY-1 and CY-2 colony morphology

表 1 CY1和CY2菌株生理生化特征

Table 1 Physiological and biochemical characteristics of CY1 and CY2

菌株编号	革兰氏染色	氧化酶	V.P测定	接触酶	甲基红测定	明胶液化	H2S试验	淀粉水解
CY1	-	+	-	+	-	-	-	-
CY2	+	-	-	+	-	-	-	-

注：表中“+”表示反应呈阳性，“-”表示呈阴性.

2.1.2 菌株16S rDNA测序和系统发育树构建

将菌株16S rDNA测序所得基因序列在NCBI中进行BLAST序列比对，可以发现，CY-1菌株与假单胞菌属同源性最高，相似度高达99.93%，CY-2菌株与戈登氏菌属同源性最高，相似度99.86%。选取部分相似度较高的菌株序列，分别构建系统发育树（见图2和图3），可确定CY-1菌株为多舌假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida），CY-2菌株为土地戈登菌（Gordonia terrae）。

图 2 菌株CY-1的系统发育树

Fig. 2 Phylogenetic tree of strain CY-1

图 3 菌株CY-2的系统发育树

Fig. 3 Phylogenetic tree of strain CY-2

2.2 菌株生长曲线

图4为2株高效降解菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中培养70 h内的生长曲线。由图可见，CY-1菌株在0~10 h段生长速度最快，为菌株生长对数期，在10~30h段，菌株生长速度平缓，进入稳定期；CY-2菌株在20~30 h段生长速度最快，为菌株生长对数期，在30~44 h段，菌株进入稳定期。在培养55 h后，两株菌均进入衰亡期，两株菌相比，CY-1菌株的生长速度要快于CY-2菌株，两株菌生长曲线的测定，为菌株降解柴油实验提供了最适的菌株培养时间^[19]。

图4 菌株CY-1和CY-2生长曲线

Fig. 4 Growth curves of strains CY-1 and CY-2

2.3 不同环境因素对菌株降解柴油性能的影响

2.3.1 pH的影响

不同pH对菌株降解柴油的影响如图5（a）所示，由图可知，pH对两株菌降解柴油有很大影响。在强酸、强碱环境下，CY-1和CY-2菌对柴油的降解率均较低，但pH为7时，两株菌对柴油的降解率均达到最高，分别为52.43 %和51.69 %。这说明强酸强碱会抑制两株菌的生长，降低其活性以及菌株对柴油的生物降解作用，这与冒学宇的研究结果一致^[20]。究其原因，可能是因为强酸强碱环境会影响菌株细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性，进而影响菌株对营养物质的吸收，降低菌株的生长速率^[21]。

图 5 不同环境因素对CY-1和CY-2菌株降解柴油的影响，（a）pH的影响，（b）接种量的影响，（c）NaCl浓度的影响，（d）柴油浓度的影响

Fig. 5 The effects of different environmental factors on the degradation of diesel oil by CY-1 and CY-2 strains. (a) the effect of pH, (b) the effect of inoculation amount, (c) the effect of NaCl concentration, and (d) the effect of diesel oil concentration

2.3.2 接种量的影响

不同接种量对菌株降解柴油的影响如图5（b）所示，由图可知，CY-1菌株接种量8 %时，对柴油降解率最高，达到65.51 %；CY-2菌株接种量为2 %时对柴油降解率最高，达到51.69 %。此外，CY-2菌株对柴油的降解率随着接种量的增加而逐渐降低，这可能是因为CY-2菌株在降解过程中对营养物质的消耗量较大^[22]，当接种量逐步增加时，因培养基中营养物质被大量消耗，使得CY-2菌株生长繁殖速度降低，进一步限制了对柴油的利用。有研究也表明，接种量会影响菌株的生长代谢，从而影响菌株对柴油降解率^[23]。

2.3.3 盐浓度的影响

不同盐浓度对菌株降解柴油的影响如图5（c）所示，由图可知，盐浓度对CY-1和CY-2菌株的降解影响非常大，两株菌对柴油的降解率均随着盐浓度的增加而逐步降低。当NaCl浓度0.5 %时，CY-1和CY-2菌株对柴油的降解效率最高，分别为52.43 %和51.69 %，而当NaCl浓度升高至2.5 %时，两株菌对柴油降解效率分别降至29.08 %和14.04 %。CY-1菌株对盐度的耐受能力明显强于CY-2菌株，CY-1菌株生长繁殖的盐浓度范围应不超过1.0 %较好，而CY-2菌株不超过0.5%。高盐浓度条件下，培养基中钠离子增多，会抑制细菌脱氢酶、脲酶等物质的产生，从而影响菌株对柴油的降解效率^[24]。因此，两菌株在降解柴油过程中，应将盐度控制在不超过0.5 %较好。

2.3.4 柴油浓度的影响

菌株对不同浓度柴油的降解效果如图5（d）所示，由图可知，CY-1菌株降解柴油的最适浓度范围在500 ~1000 mg/L，当柴油浓度为500 mg/L时，该菌株对柴油的降解率高至52.43 %，升高柴油浓度至7000 mg/L时，菌株对柴油的降解率降至20.30 %，这说明较高的柴油浓度会抑制CY-1菌株的除油效果，究其原因，可能是因为菌株氧化过程中，较高的柴油浓度阻隔了菌株与氧气的接触，导致菌株活性降低，进而降低柴油降解率^[25]，另外，也可能是由于菌株降解柴油过程中，底物碳氮比失调，菌株生长受到抑制，进而影响菌株对柴油的降解效果，该现象与邢清朝等^[26]的研究结果一致。对于菌株CY-2而言，当柴油浓度500 mg/L时，柴油降解率最低，仅为51.69 %，在柴油浓度3000 mg/L时降解率最高，达到64.87 %。可以看出，CY-2菌株适应柴油的浓度范围在3000 ~5000 mg/L，CY-2对高浓度柴油的耐受能力明显强于CY-1菌株。

2.3.5 温度的影响

温度对菌株降解柴油的影响如表2所示，由表可知，CY-1和CY-2菌株在温度30 ℃时，对柴油的降解效率最高，分别达到52.43 %和51.69%，当温度高于或低于30 ℃时，两菌株降解柴油的效率均明显下降。因此，两菌株降解柴油时，最适温度均应控制在30 ℃较好。两株菌相比较，CY-1对低温耐受能力明显强于CY-2，且均属于中温菌。

表 2 温度对CY-1和CY-2菌株降解柴油的影响

Table 2 Effect of temperature on the degradation of diesel oil by CY-1 and CY-2 strains

温度/℃	15	20	25	30	35
CY-1降解率	28.92	35.88	46.10	52.43	49.36
CY-2降解率	16.99	28.51	40.78	51.69	48.72

2.4 菌株对烷烃组分的降解能力分析

基于上述研究确定的适宜CY-1和CY-2菌株降解柴油的最佳环境条件，进一步研究了两株菌对柴油中烷烃各组分的降解能力。图6（a～b）为最佳环境条件下，两株菌对C14~C27烷烃组分降解后的气相色谱图，由图可见：与未接菌的对照组相比，经两株菌降解处理后，实验组中各烷烃组分的峰面积均大幅降低。其中，CY-1对烷烃的降解效果较好，n-C15~C25组分的降解率达到65.36 %，CY-2对n-C15~C25的降解率则达到85.83 %（见图7（a和b））。这说明两株菌对烷烃各组分的降解能力不同，对中长链烷烃均有降解效果，可稳定用于后续的柴油污染土壤修复试验。考虑到CY-2对柴油浓度的耐受范围达到3000～5000 mg/L，其最佳接种量为2%，低于CY-1菌的8%，并且，对烷烃各组分的降解率也明显高于CY-1菌，故CY-2对柴油污染的处理能力要好一些。

图 6 CY-1和CY-2菌株柴油气相色谱图

Fig.6 GC spctra of diesel oil from CY-1 and CY-2 strai

图 7 CY-1和 CY-2菌株对烷烃各组分的降解率

Fig.7 Degradation rate of alkanes by CY-1 and CY-2 strains

3 结论

（1）本试验以柴油为唯一碳源，从柴油污染土壤中筛选出两株高效柴油降解菌CY-1和CY-2，经过形态观察、生理生化实验以及16S rDNA测序比对分析，鉴定CY-1为多舌假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida），CY-2为土地戈登菌（Gordonia terrae）。

（2）菌株CY-1在培养温度30℃，初始pH为7.0，柴油浓度500 mg/L，接种量为8 %，NaCl浓度0.5 %时，对柴油的降解率最高，达到65.51 %；菌株CY-2在 培养温度30℃，初始pH为7.0，柴油浓度3000 mg/L，接种量为2 %，NaCl浓度0.5 %时，对柴油的降解率最高，达到64.87 %。

（3）菌株CY-1对链长为C15～C25的烷烃的平均降解率达到65.36 %，菌株CY-2对链长C15~C25的平均降解率达到85.83 %。两菌株对中长链烷烃有较好的降解效果。

（4）CY-2菌株对柴油的降解能力以及对环境条件耐受程度方面均强于CY-1菌株，在柴油污染土壤的修复方面更具优势。

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项目来源：西华师范大学博士启动项目（项目编号：19E058）

作者简介：陈应星（1999-），四川成都人，男，硕士研究生，主要从事污染土壤修复技术研究；E-mail:553899773@qq.com

通讯作者：王建刚 Email：wjg268@163.com

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