摘要：通过研究BGB-11417与靶蛋白结合的相互作用，创造性的在P2口袋引入并环，合成了6个结构新颖的BCL-2抑制剂，产物经1 H NMR和MS确证。以时间分辨荧光共振能量转移法（TR-FRET）测定目标化合物对BCL-2蛋白及BCL-2突变蛋白G101V和D103Y的体外抑制活性。活性结果表明化合物A、化合物B和化合物D对BCL-2及其突变蛋白G101V和D103Y有较好的抑制活性，可为合成活性更高的BCL-2抑制剂提供参考。
关键词：BCL-2抑制剂；合成；抗肿瘤活性
中图分类号：R914 文献标识码：A 文章编号：
Design,Synthesis and Activity Evaluation of Novel BCL-2 Inhibitors
Yang Liu 1,2,Wang Xinyue 2,Gao Anhui 2,3,Liu Xiaoling1*,Bai Haiyun3*
(1 Wuya College of Innovation,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China;
2 Drug Research Institute of Yangtze Delta,Nantong 226133,China;
3 Biopolar Hongye (Nantong) Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nantong 226133,China)
Abstract:To synthesize a series of novel BCL-2 inhibitors and to determine their anticancer activity.By studying the interaction between BGB-11417 and BCL-2 protein,we creatively introduce bicyclic structure into P2 pocket.Six novel BCL-2 inhibitors were synthesized and their structures were confirmed by 1H NMR spectra and MS.The inhibitory activity of the target compounds on BCL-2 and its mutant proteins G101V and D103Y in vitro was determined by time-resolved fluorescence resonance energy transfer method (TR-FRET).The results of biological evaluation indicated that compound A,compound B and compound D showed potent anticancer activities,which could provide a reference for synthesizing BCL-2 inhibitors with higher activity.
Key words:BCL-2 inhibitors;synthesis;anti-tumor activity
B细胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）家族蛋白在细胞凋亡的内源性途径中发挥着重要作用[1]。BCL-2家族蛋白根据功能可分为三类：抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白和BH3-only蛋白，其中抗凋亡蛋白包括BCL-2、BCL-XL和MCL-1等。抗凋亡蛋白的异常表达现象发生在多种不同类型的恶性肿瘤中[2-4]，并被证实与肿瘤的形成、进展和治疗耐药性等息息相关[5]。因此靶向抑制BCL-2可作为BCL-2高表达肿瘤的治疗策略之一。维奈托克（Venetoclax，VEN）是于2016年获得上市批准的BCL-2高选择性抑制剂[6]，并在慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中具有单药活性，然而，VEN仍然面临着治疗耐药性的挑战，在用VEN治疗CLL临床进展中，发现一些治疗失败的患者中出现了药物选择性BCL-2突变（G101V以及D103Y等）[7,8]。研究表明BCL-2 G101V突变使VEN对BCL-2的亲和力降低了约180倍[9]。因此，BCL-2抑制剂具有巨大的开发潜力，目前不少药物已经进入了临床试验阶段。
APG-2575是亚盛医药研发的新型BCL-2选择性抑制剂[10]，目前处于Ⅲ期临床研究阶段。APG-2575与VEN之间存在两个关键结构差异：在位点1，二甲基被环丁基环取代，在位点2，四氢-2H-吡喃基团被1,4-二氧杂环己烷取代，结构与活性关系研究证实，位点1和2的改造是可行的，使得APG-2575仍然对BCL-2具有有效的结合亲和力。BGB-11417是由百济神州研发的一种高选择性的BCL-2抑制剂[11]，目前处于Ⅲ期临床研究阶段。与APG-2575相比，BGB-11417对进入核心部位P2口袋结构域的氯苯基部分做了更大的修改，研究表明P2口袋是增强化合物对BCL-2突变体G101V活性的关键部位[6]。经文献检索，暂未发现P2口袋结构域含并环片段的BCL-2抑制剂，本文创造性的在P2口袋部位引入并环片段，设计合成了2个全新的化合物（化合物A和化合物F），对其中活性较好的化合物A的并环部分的手性进行了分别合成得到化合物B~E。我们使用专利中相同的方法合成了化合物Y[12]（BGB-11417的消旋体）作为阳性参照物。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试药
磁力搅拌器（德国IKA公司）、集热式恒温磁力搅拌器（巩义予华仪器有限公司）、超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）、紫外可见分光光度计（安捷伦科技公司）、准微量天平（德国赛多利斯公司，精度0.01 mg）、核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）、高分辨质谱仪（安捷伦科技公司）、超高液相色谱仪（沃特世公司）、快速制备色谱仪（拜泰齐贸易（上海）有限公司）。薄层析硅胶板（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司），柱色谱采用100~200目硅胶（青岛海洋化工厂生产）；VEN（纯度＞99.00%，上海与昂化工有限公司）；BCL-2蛋白（北京义翘神州科技股份有限公司）；BCL-2 G101V和BCL-2 D103Y蛋白（通过大肠杆菌系统表达纯化获得）（百极弘烨（南通）医药科技有限公司）；蛋白相互作用检测试剂盒（Cisbio公司）。
所用化学试剂均为市售化学纯或分析纯产品，除特别说明外，不经处理直接使用。
1.2 合成路线及方法
目标化合物的合成路线见图2。
1.2.1 中间体a-e的合成[13]
在干燥的100 mL单口瓶中依次加入2-苯基乙醇(1.0 g，8.20 mmol)、(S)-叔丁基2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸酯(1.6 g，8.20 mmol)和8 mL二氯甲烷，冰浴下降温至0 ℃，缓慢加入2 mL三氟甲烷磺酸，室温搅拌1 h。反应结束后，用50 mL冰水淬灭反应，V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶1(50 mL×2)萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩后得到1.6 g棕色油状物a。中间体a经快速制备色谱仪(流动相：乙腈和0.1%三氟乙酸)分离得到650 mg透明粘性液体b，收率为40.6%和420 mg透明粘性液体c，收率为26.3%。
中间体d和e使用(R)-叔丁基2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸酯作原料以相同的方式得到。
(S)-2-((S)异苯并二氢吡喃-1-基)吡咯烷(b)：1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.32~7.19(m，4H)，4.95(d，J=4.2 Hz，1H)，4.21~4.17(m，1H)，4.02(d，J=7.1 Hz，1H)，3.77(ddd，J=10.4，9.9，3.3 Hz，1H)，3.15~3.01(m，3H)，2.70(dt，J=6.8，3.1 Hz，1H)，2.13~1.97(m，3H)，1.93~1.80(m，1H)。ESI MS(m/z)：204.40[M+H]+。
(S)-2-((R)异苯并二氢吡喃-1-基)吡咯烷(c)：1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.28~7.17(m，4H)，5.15(s，1H)，4.34~4.30(m，1H)，4.24~4.18(m，1H)，3.74(td，J=11.6，3.0 Hz，1H)，3.22(ddd，J=10.0，7.4，5.1 Hz，1H)，3.19~3.12(m，1H)，3.01(ddd，J=17.1，11.9，6.0 Hz，1H)，2.66(dd，J=15.3，1.2 Hz，1H)，1.95~1.73(m，2H)，1.66~1.52(m，2H)。ESI MS(m/z)：204.40[M+H]+。
(R)-2-((R)异苯并二氢吡喃-1-基)吡咯烷(d)：1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.34~7.19(m，4H)，4.95(d，J=4.2 Hz，1H)，4.23~4.09(m，2H)，3.76(td，J=10.7，3.7 Hz，1H)，3.20~3.01(m，3H)，2.69(dt，J=16.3，3.1 Hz，1H)，2.16~1.84(m，4H)。ESI MS(m/z)：204.11[M+H]+。
(R)-2-((S)异苯并二氢吡喃-1-基)吡咯烷(e)：1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.26~7.19(m，4H)，5.15(s，1H)，4.30(dd，J=8.0，5.7 Hz，1H)，4.22(dd，J=11.2，5.1 Hz，1H)，3.74(td，J=11.6，3.0 Hz，1H)，3.25~3.14(m，2H)，3.06~2.95(m，1H)，2.66(d，J=16.5 Hz，1H)，1.92~1.75(m，2H)，1.64~1.54(m，2H)。ESI MS(m/z)：204.20[M+H]+。
1.2.2 中间体(2S)-2-(1,3-二氢异苯并呋喃-1-基)吡咯烷(f)的合成[13]
1）100 mL单口瓶中依次加入2-溴苄醇(1.0 g，5.35 mmol)、1H-咪唑(728 mg，10.70 mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(1.6 g，10.70 mmol)和10 mL二氯甲烷，室温搅拌2 h。用50 mL水在0 ℃下淬灭反应，60 mL二氯甲烷萃取，有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱色谱纯化(流动相：石油醚)得到1.5 g无色油状物2，收率为93.8%。
2）向干燥的100 mL三颈瓶中加入中间体2(1.5 g，4.98 mmol)和30 mL无水四氢呋喃，氮气保护下冷却至-78 ℃，逐滴加入2.4 mol/L的正丁基锂正己烷溶液(8.3 mL，19.92 mmol)，滴加完毕，保持-78 ℃反应30 min。然后逐滴加入在无水四氢呋喃(5 mL)中的(S)-叔丁基2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸酯(1.5 g，7.47 mmol)，反应混合物在-78 ℃下继续搅拌1 h。反应结束后，用50 mL饱和氯化铵溶液淬灭反应，40 mL乙酸乙酯萃取，分离有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析纯化(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=15∶1)得到560 mg无色油状液体3，收率为26.7%。ESI MS(m/z)：422.04[M+H]+。
3）向100 mL单口瓶中依次加入中间体3(560 mg，1.33 mmol)、1.0 mol/L四丁基氟化铵四氢呋喃溶液(1 mL)和10 mL四氢呋喃，室温反应2 h。TLC监测反应完全，加入50 mL乙酸乙酯稀释反应液，用水洗涤(50 mL×2)，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析纯化(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1)得到385 mg无色油状液体4，收率为94.4%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.55~7.48(m，1H)，7.45~7.40(m，1H)，7.26~7.21(m，2H)，5.26(d，J=32.9 Hz，1H)，5.13~5.05(m，1H)，4.73~4.59(m，1H)，4.12~3.98(m，1H)，3.83~3.71(m，1H)，3.47~3.36(m，1H)，1.93(d，J=12.6 Hz，2H)，1.79(d，J=31.4 Hz，1H)，1.68~1.56(m，1H)，1.43(d，J=9.3 Hz，9H)。ESI MS(m/z)：208.1[M-Boc+H]+。
4）冰水浴下向50 mL单口瓶中依次加入中间体4(385 mg，1.25 mmol)、甲磺酰氯(98 mg，1.25 mmol)、三乙胺(380 mg，3.76 mmol)和5 mL乙酸乙酯，室温搅拌30 min后减压蒸除溶剂，得到粗产物。粗产物溶于5 mL四氢呋喃中，加入叔丁醇钾(281 mg，2.51 mmol)，室温搅拌1 h。反应结束后，加入50 mL乙酸乙酯稀释反应液，用水(40 mL×3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析纯化(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=20∶1)得到175 mg无色油状物5，收率为48.5%。ESI MS(m/z)：190.12[M-Boc+H]+。
5）向50 mL单口瓶中依次加入中间体5(175 mg，0.61 mmol)、3.0 mol/L盐酸的乙酸乙酯溶液(2 mL)和4 mL乙酸乙酯，室温搅拌1 h。TLC监测，待完全反应之后，减压蒸除溶剂，得到115 mg无色油状物f，收率为100%。ESI MS(m/z)：190.01[M+H]+。
1.2.3 中间体7a-7f的合成
向50 mL单口瓶中依次加入中间体a-f(3.20 mmol)、2-氧代-7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-甲酸叔丁酯(4.8 mmol)、醋酸(3.20 mmol)和10 mL二氯乙烷，45 ℃反应1 h，反应液冷却至室温，分批加入醋酸硼氢化钠(6.40 mmol)，室温搅拌3 h。TLC监测反应完毕，加入50 mL水和40 mL乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析纯化(V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=30∶1)得到淡黄色粘性液体6a-6f，收率为65.0%~85.5%。将中间体6a-6f溶于4 mL乙酸乙酯中，加入3.0 mol/L盐酸的乙酸乙酯溶液(2 mL)，室温搅拌1 h。TLC监测，待完全反应之后，减压蒸除溶剂，得到无色油状物7a-7f。
1.2.4 中间体8a-8f的合成
按文献[14]方法制得中间体11，收率为69.1%。向50 mL单口瓶中依次加入中间体7a(650 mg，1.99 mmol)、中间体11(795 mg，1.67 mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(304 mg，0.33 mmol)、2-二环己基膦-2',4',6'-三异丙基联苯(X-phos)(315 mg，0.66 mmol)、碳酸铯(1.6 g，4.91 mmol)和10 mL二氧六环，氮气保护，80 ℃反应3 h。反应结束后，将反应液冷却至室温，用硅藻土过滤，滤渣用20 mL乙酸乙酯洗涤，滤液加入50 mL水和30 mL乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后经硅胶柱层析纯化(V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=30∶1)得到330 mg棕色粘性液体8a，收率为27.5%。
中间体8b或8d使用7b或7d作原料以相同的方式得到；中间体8c或8e使用7c或7e作原料，并用叔丁醇钠代替碳酸铯以相同的方式得到；中间体8f使用7f作原料，并用S-(-)-1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(BINAP)代替X-phos以相同的方式得到。
1.2.5 化合物A~F的合成
1）向50 mL单口瓶中依次加入中间体8a-8f(0.46 mmol)、氢氧化钠(4.6 mmol)、无水甲醇(4 mL)和水(2 mL)，60 , ℃反应16 h。反应结束后，将反应液用1 mol/L盐酸调节至pH=5，40 mL二氯甲烷萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到褐色粘性固体9a-9f。
2）按文献[14]方法制得中间体12，收率为27.8%。向50 mL单口瓶中依次加入中间体9a-9f(0.21 mmol)、中间体12(0.23 mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(0.32 mmol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.32 mmol)、三乙胺(0.42 mmol)和10 mL二氯甲烷，35 ℃反应3 h。TLC监测，待完全反应之后，减压蒸除溶剂，经薄层析硅胶板纯化(展开剂：V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1)得到黄色固体10a-10f，收率为25.5%~55.0%。
3）向50 mL单口瓶中依次加入中间体10a-10f(0.11 mmol)、1.0 mol/L四丁基氟化铵四氢呋喃溶液(1 mL)和10 mL无水四氢呋喃，80 ℃反应3 h。TLC监测反应完全后，将反应液冷却至室温，加入50 mL水和50 mL乙酸乙酯萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩后经薄层析硅胶板纯化(展开剂：V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶1)得到黄色固体A~F，收率为25.5%~70.0%。
化合物A~F及阳性参照物Y的谱图数据如下：
A：黄色固体，收率45.5%，HPLC纯度93.19%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 11.70(s，1H)，11.44(s，1H)，8.62~8.55(m，2H)，8.06(dd，J=6.4，2.6 Hz，1H)，7.80(d，J=9.4 Hz，1H)，7.53(ddd，J=14.5，9.8，5.8 Hz，3H)，7.28(s，1H)，7.22(dd，J=8.1，4.5 Hz，3H)，7.09(d，J=9.3 Hz，1H)，6.77~6.69(m，1H)，6.42~6.38(m，1H)，6.21(d，J=19.4 Hz，1H)，5.12(s，1H)，4.94(s，1H)，4.23(s，2H)，4.11(s，1H)，3.99(s，1H)，3.77~3.70(m，1H),3.53(d，J=8.2 Hz，1H)，3.06(d，J=26.5 Hz，6H)，2.66(d，J=11.9 Hz，1H)，2.30~2.06(m，4H)，1.92(s，J, =8.1 Hz，2H)，1.68(d，J=12.7 Hz，4H)，1.59~1.52(m，10H)，1.14(s，2H)，1.10(s，3H)。ESI MS(m/z)：理论值：C49H58N7O8S+[M+H]+904.40，实测值：904.70。
B：黄色固体，收率64.5%，HPLC纯度95.18%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 11.72(s，1H)，11.46(s，1H)，8.58(t，J=4.5 Hz，2H)，8.06(d，J=2.6 Hz，1H)，7.80(dd，J=9.3，2.2 Hz，1H)，7.55~7.49(m，3H)，7.29(d，J=3.3 Hz，1H)，7.22(dd，J=12.2，3.6 Hz，3H)，7.10(d，J=9.5 Hz，1H)，6.71(dd，J=9.0，2.1 Hz，1H)，6.40(dd，J=3.3，1.9 Hz，1H)，6.19(d，J=1.9 Hz，1H)，4.95(d，J=2.9 Hz，1H)，4.23~4.20(m，1H)，4.00(s，1H)，3.53(s，1H)，3.40~3.37(m，1H)，3.05(dd，J=32.5，15.7 Hz，7H)，2.70(s，1H)，2.68~2.63(m，1H)，2.27~2.10(m，3H)，1.93(d，J=8.7 Hz，2H)，1.69(d，J=12.8 Hz，3H)，1.57(t，J=15.5 Hz，9H)，1.45~1.35(m，4H)，1.15(s，2H)，1.11(s，3H)。ESI MS(m/z)：理论值：C49H58N7O8S+[M+H]+904.40，实测值：904.60。
C：黄色固体，收率44.2%，HPLC纯度96.93%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 11.71(s，1H)，11.45(s，1H)，8.60~8.55(m，2H)，8.06(t，J=3.2 Hz，1H)，7.81(dd，J=9.2，2.2 Hz，1H)，7.56(d，J=2.5 Hz，1H)，7.52(dd，J=6.1，3.0 Hz，2H)，7.25~7.23(m，1H)，7.22~7.20(m，2H)，7.19(s，1H)，7.10(d，J=9.4 Hz，1H)，6.78~6.74(m，1H)，6.40(dd，J=3.3，1.9 Hz，1H)，6.24(d，J=2.0 Hz，1H)，5.12(s，1H)，4.25~4.21(m，1H)，4.10(d，J=8.5 Hz，1H)，3.99~3.93(m，1H)，3.77~3.72(m，1H)，3.10(s，2H)，2.99(dd，J=21.6，10.8 Hz，3H)，2.66(d，J=14.7 Hz，1H)，2.41(s，1H)，2.23~2.03(m，4H)，1.85(dtd，J=19.2，13.3，5.8 Hz，3H)，1.72~1.60(m，6H)，1.55(d，J=15.4 Hz，10H)，1.20~1.12(m，2H)，1.10(s，3H)。ESI MS(m/z)：理论值：C49H58N7O8S+[M+H]+904.40，实测值：904.60。
D：黄色固体，收率68.6%，HPLC纯度98.35%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 11.70(s，1H)，11.44(s，1H)，8.58(dd，J=8.0，4.1 Hz，2H)，8.05(d，J=2.6 Hz，1H)，7.80(dd，J=9.3，2.2 Hz，1H)，7.56~7.47(m，3H)，7.32~7.27(m，1H)，7.23(t，J=3.7 Hz，2H)，7.20(d，J=3.7 Hz，1H)，7.09(d，J=9.4 Hz，1H)，6.70(dd，J=9.0，2.1 Hz，1H)，6.40(dd，J=3.4，1.9 Hz，1H)，6.19(d，J=2.0 Hz，1H)，4.94(d，J=2.9 Hz，1H)，4.24~4.18(m，1H)，3.99(s，1H)，3.73(dd，J=11.1，7.9 Hz，1H)，3.53(d，J=8.2 Hz，1H)，3.12~2.94(m，7H)，2.70~2.65(m，1H)，2.29~2.08(m，3H)，1.92(d，J=8.5 Hz，2H)，1.69(d，J=12.5 Hz，3H)，1.56(dd，J=19.2，12.1 Hz，10H)，1.47~1.36(m，4H)，1.15(d，J=7.8 Hz，2H)，1.10(s，3H)。ESI MS(m/z)：理论值：C49H58N7O8S+[M+H]+904.40，实测值：904.60。
E：黄色固体，收率54.3%，HPLC纯度95.31%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 11.70(s，1H)，11.44(s，1H)，8.58(dd，J=8.0，4.1 Hz，2H)，8.05(d，J=2.6 Hz，1H)，7.80(dd，J=9.3，2.2 Hz，1H)，7.56~7.47(m，3H)，7.32~7.27(m，1H)，7.23(t，J=3.7 Hz，2H)，7.20(d，J=3.7 Hz，1H)，7.09(d，J=9.4 Hz，1H)，6.70(dd，J=9.0，2.1 Hz，1H)，6.40(dd，J=3.4，1.9 Hz，1H)，6.19(d，J=2.0 Hz，1H)，4.94(d，J=2.9 Hz，1H)，4.24~4.18(m，1H)，3.99(s，1H)，3.73(dd，J=11.1，7.9 Hz，1H)，3.53(d，J=8.2 Hz，1H)，3.05(dd，J=32.3，15.7 Hz，7H)，2.70~2.64(m，1H)，2.19(ddd，J=49.6，13.5，6.8 Hz，3H)，1.92(d，J=8.5 Hz，2H)，1.74~1.51(m，13H)，1.46~1.35(m，4H)，1.15(d，J=7.8 Hz，2H)，1.10(s，3H)。ESI MS(m/z)：理论值：C49H58N7O8S+[M+H]+904.40，实测值：904.60。
F：黄色固体，收率37.5%，HPLC纯度93.70%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 11.71(s，1H)，11.45(s，1H)，8.58(dd，J=7.1，4.1 Hz，2H)，8.07(t，J=2.4 Hz，1H)，7.83~7.79(m，1H)，7.56(t，J=2.8 Hz，1H)，7.54~7.50(m，2H)，7.40~7.32(m，4H)，7.10(d，J=9.3 Hz，1H)，6.76(d，J=6.6 Hz，1H)，6.42~6.38(m，1H)，6.25~6.21(m，1H)，5.59(s，1H)，5.28~5.20(m，1H)，5.18~5.02(m，2H)，3.96~3.91(m，1H)，3.78(d，J=8.4 Hz，1H)，3.52(s，1H)，3.10(s，3H)，2.39(s，1H)，2.10(dd，J=20.8，11.9 Hz，4H)，1.96(dd，J=30.1，11.0 Hz，3H)，1.82(s，1H)，1.69(d，J=12.5 Hz，3H)，1.56(d，J=7.2 Hz，8H)，1.48(s，3H)，1.14(s，2H)，1.10(s，3H)。MS(ESI)m/z：890.40 [M＋H]＋。ESI MS(m/z)：理论值：C48H56N7O8S+[M+H]+890.38，实测值：890.40。
Y：黄色粉末固体，收率60.0%，HPLC纯度97.76%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 11.71(s，1H)，11.45(s，1H)，8.63~8.53(m，2H)，8.04(d，J=2.5 Hz，1H)，7.81~7.76(m，1H)，7.61(d，J=7.6 Hz，1H)，7.54~7.45(m，3H)，7.37(d，J=3.9 Hz，1H)，7.24(s，1H)，7.11(s, 1H)，6.98(s，1H)，6.68(d，J=9.2 Hz，1H)，6.38(d，J=1.8 Hz，1H)，6.17(s，1H)，5.32(t，J=4.8 Hz，1H)，4.78(d，J=8.3 Hz，1H)，4.23(d，J=6.5 Hz，1H)，4.13(d，J=5.6 Hz，1H)，3.70~3.64(m，2H)，3.31~3.26(m，2H)，3.06(s，1H)，2.95(s，1H)，2.33(s，1H)，2.11(s，3H)，2.03~1.94(m，5H)，1.75(s，1H)，1.65(d，J=6.6 Hz，3H)，1.54(d，J=12.8 Hz，2H)，1.44(d，J=6.9 Hz，4H)，1.34(d，J=6.1 Hz，4H)，1.23(s，9H)。ESI MS(m/z)：理论值：C49H60N7O7S+[M+H]+890.42，实测值：890.60。
1.3 体外生物活性评价
本文采用时间分辨荧光共振能量转移测定化合物体外抑制活性。使用测试方法为：首先将化合物样品用DMSO稀释至终浓度的50倍，随后配制反应缓冲液（20 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，0.01% Tween-20），用反应缓冲液稀释至测试终浓度的5倍（5X母液），依次将2 μL 5X母液和4 μL His-tagged标记的BCL-2、BCL-2 G101V或BCL-2 D103Y蛋白（终浓度0.2 nmol/L），添加到测定孔中，每个浓度设2个复孔，并设置DMSO对照孔作为阴性对照，设置不含蛋白对照孔为空白对照。将培养板在25 ℃下孵育30 min后，加入4 μL Bio-Bim底物（终浓度0.2 nmol/L），室温反应1 h。
反应结束再添加10 μL检测抗体（含0.4 nmol/L anti-His抗体和0.4 nmol/L streptavidin-XL665），在25 ℃下孵育18 h。用Envision微孔板读数器读取培养板在620 nm和665 nm处的荧光信号强度值（RFU），计算每个孔的比率（Ratio）：
Ratio=RFU665 nm/RFU620 nm
随后根据各化合物浓度下的Ratio计算对应浓度的化合物对BCL-2蛋白、BCL-2 G101V或BCL-2 D103Y蛋白与BH3-only蛋白相互作用的抑制活性（Activity%）。
计算不同浓度化合物处理下得到的活性剂量依赖关系，根据[Inhibition] vs normalized response-variable slope模型拟合出化合物对BCL-2及其突变型的IC50值。计算所用软件为Graphpad Prism 8.0。
2 结果与讨论
目标化合物对BCL-2及其突变蛋白G101V和D103Y的体外抑制活性见表1。
表1 目标化合物的体外抗肿瘤活性
Tab.1 Antitumor activities of the target compounds in vitro
化合物 | IC50/(nmol/L) | ||
BCL-2 | BCL-2 G101V | BCL-2 D103Y | |
A | 5.10 | 49.67 | 258.50 |
B | 4.13 | 82.63 | 113.59 |
C | 25.19 | 1228.00 | 2909.50 |
D | 1.21 | 69.54 | 354.70 |
E | 25.07 | 1088.50 | 4470.00 |
F | 9.32 | 3353.50 | 156.00 |
0.35 | 16.06 | 61.59 | |
VEN | 2.80 | 267.35 | 593.25 |
对BCL-2及其突变蛋白G101V和D103Y的体外抑制活性结果显示：化合物A~F对BCL-2及其突变蛋白显示出不同程度的抑制活性，其中化合物D对BCL-2的抑制活性较强（IC50值为1.21 nmol/L），化合物A对BCL-2 G101V的抑制活性较好（IC50值为49.67 nmol/L），化合物B对BCL-2 D103Y的抑制活性较好（IC50值为113.59 nmol/L）。
3 结论
本文创造性的在P2口袋部位引入并环片段，设计合成了6个化合物。初步的体外活性数据表明，化合物A、化合物B和化合物D对BCL-2突变体G101V和D103Y的抑制活性都优于阳性对照药VEN（唯一上市的BCL-2抑制剂），化合物D对BCL-2的抑制活性优于对照药VEN，因此值得进一步开展结构优化研究。为进一步提升目标化合物对靶标的亲和性，可考虑在化合物D结构中异色满片段上的苯环引入取代基，增强化合物在P2口袋的疏水相互作用，进而增强化合物的活性。因此，本课题组后期还需要对改构化合物进行更深入的研究，期望可以得到比BGB-11417更优的新型BCL-2抑制剂。
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