苯酚硫酸法测定总糖含量的试验原理验证及拓展应用
韩书昌，吴洪军，孙靖辰，张跃新，郭劲鹏，栾泰龙，付婷婷*
黑龙江省林业科学院牡丹江分院，黑龙江牡丹江 中国 157011
摘要：通过对苯酚硫酸法试验原理的验证，明确该方法可测定糖的范围种类。用该方法分别测定几种戊糖、己糖、双糖、多糖以及半乳糖醛酸的含量，其中包括还原糖和非还原糖。以葡萄糖为对照品，测得糖含量分别为阿拉伯糖39.73%，核糖71.77%，木糖85.16%，葡萄糖83.07%，果糖76.83%，蔗糖82.09%，麦芽糖79.96%，乳糖66.69%，葡聚糖98.25%，糊精102.55%，琼脂63.65%，柑橘果胶64.59%，可溶性淀粉85.47%，半乳糖醛酸26.26%。实验结果表明，该方法对还原糖和非还原糖含量均可测定。本实验验证明确了该方法的实验原理是戊糖、己糖、双糖、多糖以及半乳糖醛酸和苯酚硫酸都有颜色反应，根据其吸收值和糖浓度的线性关系测定含量，明确提出了苯酚硫酸法对于各种可溶性糖（包括单糖，寡糖和多糖）及糖醛酸含量均可直接测定。
关键词：苯酚硫酸法，原理，多糖，单糖，含量
Experimental principle verification and -application of phenol-sulfuric acid method for determination of total polysaccharide content
HAN Shuchang , WU Hongjun, SUN Jingchen, ZHANG Yuexin, GUO Jinpeng, LUAN Tailong, FU Tingting*
Mudanjiang branch of Heilongjiang Academy of Forestry, Mudanjiang, 157011 China
Abstract: Through the verification of the experimental principle of phenol-sulfuric acid method, it is clear that the range of sugar types can be determined by this method. The contents of pentose, hexose, disaccharide, polysaccharide and galacturonic acid were determined by this method,which include reducing sugar and non-reducing sugar. With glucose as the control product, the measured polysaccharide content was arabinose 39.73%, ribose 71.77%, xylose 85.16%, glucose 83.07%, fructose 76.83%, sucrose 82.09%, maltose 79.96%, lactose 66.69%, glucan 98.25%, dextrin 102.55%, agar 63.65%, citrus pectin 64.59%, soluble starch 85.47%, galacturonic acid 26.26%, respectively. The experimental results showed that the method can determine both reducing sugar and non-reducing sugar content. This experiment verified that the experimental principle of the method is pentose, hexose, disaccharide, polysaccharide, galacturonic acid and phenol sulfuric acid have color reaction. According to the linear relationship between the absorption value and the concentration of sugar, it is clearly proposed that the phenol sulfuric acid method can directly determine the content of various soluble sugars (including monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides) and uronic acid.
Key words: phenol-sulfuric acid method, principle, polysaccharide, monosaccharide, content.
中图分类号：TS225.4 文献标识码：A
苯酚硫酸法是测定多糖的主要方法[1-8]，很多文献实验都证明该方法优于其他方法[9-13]，该试验方法操作简单，稳定性好，灵敏度高，被广泛用于对植物和食用菌类多糖成分的含量测定[14-16]。在GB/T15672-2009食用菌中总糖含量的测定方法中说明，该方法的实验原理为，多糖水解成还原糖后，在硫酸作用下生成糖醛衍生物，和苯酚反应生成黄色物质进行比色测定[17]，需要将多糖水解成还原糖方可测定；在SN/T4260-2015出口植物源食品中粗多糖的测定中的原理为，多糖在浓硫酸作用下，先水解成单糖，并迅速生成糖醛衍生物，与苯酚作用生成黄色物质显色测定[18]。在张惟杰的糖复合物生化研究技术一书中，关于该实验方法的原理阐述如下，苯酚硫酸可与游离的或寡糖，多糖中的己糖，糖醛酸起显色反应，在490 nm处（戊糖和糖醛酸在480 nm）有最大吸收[19]，若以葡萄糖为对照品要乘以0.9为矫正系数；此外，徐光域提出硫酸能使多糖水解并缩合成糖醛，再与苯酚形成显色[20]。还有文献表明苯酚硫酸法通常使用葡萄糖或单糖作为标准物来衡量样品的总糖含量[21]。为验证上述实验原理，项目组测定了几种戊糖、己糖、双糖、多糖、糖醛酸中的糖含量，实验中发现对于戊糖，己糖，多糖，糖醛酸都可与苯酚硫酸起显色反应，其吸收值与糖含量呈线性关系，对苯酚硫酸法的实验原理的表达更加明确具体，同时也进一步拓展了苯酚硫酸法测定糖含量的应用范围，为正确使用该方法进行糖成分研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
D-无水葡萄糖（河南标准物质中心，批号BP26955）；D-半乳糖醛酸（河南标准物质中心，批号MI27112）；葡聚糖（Mw=1.26×104，国家标准物质，中国计量科学研究院，批号GBW050005）；阿拉伯糖、木糖、核糖、果胶，均购自上海颖心实验室设备有限公司；葡萄糖，果糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，琼脂，糊精，淀粉，等及其他化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-1800紫外分光光度计（上海美谱达），BSA224S电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），DSH-50-10水分快速测定仪（上海越平科学仪器制造有限公司）
1.3 样品处理
各种试剂按照GB/T15672-2009中方法配制，葡萄糖，半乳糖醛酸，葡聚糖标准品干燥恒重以后称量，加水溶解定容。
其他实验原料分别精确称取0.2 g左右，用水直接溶解或加热溶解，定容至250 mL，供测试用。
1.4 标准曲线绘制
参考文献[7,22,23]的方法，并稍作修改。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖标准溶液至15 mL具塞试管中，用水补至1.0 mL，继续加入1.0 mL的5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL浓硫酸，震荡溶液，然后将试管放在30°C水浴锅中反应30 min，在488 nm（该处为测定最大吸收波长）测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，制定标准曲线。
1.5 数据处理
采用Excel2010软件和spss20.0对数据进行统计分析，实验结果均采用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1. 最大吸收波长测定
精密量取下面样品溶液，按1.4项下操作方法测定吸光度，选择不同波长测定，测定样品最大吸收波长，结果如表1所示。表1数据表明，己糖、双糖、葡聚糖在488 nm有最大吸收，戊糖在480 nm有最大吸收，在相同浓度条件下阿拉伯糖和其他糖比，其吸收值在各个波长都明显低很多，这说明戊糖、己糖、双糖、多糖、糖醛酸皆可与硫酸苯酚起显色反应，在不同波长有最大吸收，且吸收值和浓度呈线性关系。
表1 不同单糖、双糖和多糖的最大吸收波长
Table 1 Maximum absorption wavelengths of different monosaccharides, disaccharides and polysaccharides
样品名称/波长（nm） | 490 | 488 | 486 | 482 | 480 | 478 |
葡萄糖 | 1.02 | 1.025 | 1.021 | 0.978 | 0.940 | 0.896 |
果糖 | 0.824 | 0.83 | 0.826 | 0.788 | 0.756 | 0.732 |
阿拉伯糖 | 0.423 | 0.462 | 0.489 | 0.543 | 0.553 | 0.55 |
木糖 | 0.924 | 1.002 | 1.067 | 1.167 | 1.183 | 1.174 |
核糖 | 0.895 | 0.898 | 0.985 | 1.008 | 1.070 | 1.063 |
蔗糖 | 0.824 | 0.830 | 0.826 | 0.788 | 0.756 |
|
葡聚糖 | 1.052 | 1.058 | 1.053 | 1.008 | 0.969 |
|
半乳糖 | 0.609 | 0.609 | 0.603 | 0.569 | 0.545 |
|
葡萄糖醛酸 | 0.153 | 0.157 | 0.159 | 0.158 | 0.154 | 0.16/484 |
半乳糖醛酸 | 0.192 | 0.194 | 0.196 | .192 | 0.186 | 0.195/484 |
2.2 标准曲线的绘制
由图1可知，葡萄糖标准曲线回归方程为Y=0.0119X+0.0235，R2=0.9991，线性范围良好，可用于后续实验。
图1 葡萄糖的标准曲线
Fig. 1 Standard curve of glucose
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度实验
精密量取葡萄糖对照品溶液0.4 mL，按1.4项下的操作方法测定吸光度，重复测定6次，测定结果见表2，RSD值为1.05%，结果表明，仪器精密度良好。
表2 精密度实验结果
Table 2 Precision test results
次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A(488 nm) | 0.433 | 0.426 | 0.427 | 0.425 | 0.426 | 0.419 |
2.3.2 稳定性实验
精密量取葡萄糖对照品溶液0.5 mL，按1.4项下的操作方法测定吸光度，每隔10 min测定1次，共测定1 h，测定结果见表3，RSD值为4.18%，证明该实验期内测试数据稳定。
表3 稳定性实验结果
Table 3 Stability test results
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
0.525 | 0.526 | 0.525 | 0.525 | 0.523 | 0.524 |
2.3.3 重现性实验
精密量取葡萄糖对照品溶液0.5 mL，按1.4项下的操作方法测定吸光度，测定5次，结果表明RSD值为2.67%，证明重现性稳定。
表4 重现性实验结果
Table 4 Reproducibility experiment results
次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | RSD% |
A(488 nm) | 0.516 | 0.507 | 0.524 | 0.513 | 0.543 | 2.67 |
2.3.4加标回收率实验
精密量取葡聚糖溶液0.5 mL，加入葡萄糖标准品溶液0.5 mL，按1.4项下的操作方法测定吸光度，测定5次，测定结果如表5所示，RSD值1.25%，证明方法准确可靠。
表5 加标回收率实验结果
Table 5 Experimental results of recovery rate with added standard
2.4 样品多糖含量测定结果
样品中的水分含量会直接影响浓度[24]，因此脱水干燥就变得十分重要。本研究分别精密量取样品糖测试液0.5 mL，按照1.4项下的操作方法测定吸光度，其中糊精、琼脂、柑橘果胶为自然含水，而其他样品均为去除水分之后的干重数据，在此基础上计算糖含量，结果如表6所示。表6数据表明，戊糖、己糖、双糖、多糖、糖醛酸用苯酚硫酸法皆可直接测定出糖含量，以葡萄糖做对照品，测定不同糖含量结果不同，说明不同糖需要有换算系数，特别是阿拉伯糖，浓度和其他糖接近，其不同波长吸收值和含量测定值都比较低，说明本实验方法测定阿拉伯糖含量需要有换算系数，灵敏度也比较低。
由表可知，不同糖的测定值结果各不相同。测定结果表明，还原糖和非还原糖皆可与苯酚硫酸生成显色物质，多糖不用水解就可以生成显色物质。表6中半乳糖醛酸使用样品为标准品，其实际含量与测定值的比值为换算系数，换算系数比较大，证明方法的灵敏度比较低，可以测定出半乳糖醛酸的含量，不宜做专用方法。
表6 样品糖含量结果
Table 6 Results of sugar content in samples
名称 | 样品名称 | 测定值% |
戊糖 | 阿, 拉伯糖 | 38.73 |
木糖 | 85.16 | |
核糖 | 71.77 | |
己糖 | 葡萄糖 | 83.07 |
果糖 | 76.83 | |
双糖 | 蔗糖 | 82.09 |
麦芽糖 | 79.96 | |
乳糖 | 66.69 | |
多糖 | 葡聚糖 | 98.25 |
可溶性淀粉 | 85.47 | |
糊精 | 102.55 | |
琼脂 | 63.65 | |
柑橘果胶 | 64.59 | |
糖醛酸 | 半乳糖醛酸 | 26.26 |
注：半乳糖醛酸实际含量为100%，但测定值为26.26%，由此可知换算系数为3.8。
2.5 葡萄糖回收率实验
精密量取葡萄糖标准溶液0.5 mL，按1.4项下的方操作法测定吸光度，测定5次，测定结果如表7所示，RSD值0.91%，证明方法准确性好。
表7 葡萄糖回收率实验结果
Table 7 Experimental results of glucose recovery
次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均回收率 | RSD% |
含量（%） | 98.2 | 96.64 | 98.81 | 98.4 | 98.81 | 98.17±0.9 | 0.91 |
2.6 葡聚糖回收率实验
精密量取葡聚糖标准溶液0.5 mL，按1.4项下的方法测定吸光度测定吸收度测定5次，测定结果如表8所示，RSD值1.25%，证明方法准确性好。
表8 葡聚糖回收率实验结果
Table 8 Experimental results of dextran recovery
次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均回收率 | RSD% |
含量（%） | 98.3 | 96.5 | 99.9 | 97.71 | 99.3 | 98.34±1.33 | 1.36 |
2.7 回收率差异性比较
对表7和表8中回收率进行差异显著性比较，结果如表9所示。葡萄糖和葡聚糖样品的回收率数据无显著性差异，说明用这两种糖做标准品的测定结果一致，不需要校正系数，这与文献资料[19]中的结果不一致。
表9 葡萄糖和葡聚糖的差异显著性比较
Table 9 Comparison of the difference between glucose and dextran
独立样本检验 | ||||||||||
| 莱文方差等同性检验 | 平均值等同性 t 检验 | ||||||||
F | 显著性 | t | 自由度 | Sig.（双尾） | 平均值差值 | 标准误差差值 | 差值 95% 置信区间 | |||
下限 | 上限 | |||||||||
含量 | 假定等方差 | 1.255 | .295 | -.768 | 8 | .465 | -.57000 | .74247 | -2.28213 | 1.14213 |
不假定等方差 |
|
| -.768 | 6.815 | .468 | -.57000 | .74247 | -2.33536 | 1.19536 | |
3 讨论
本项目实验对苯酚硫酸法测定的原理验证结果说明，苯酚硫酸法实验原理应该拓展为，苯酚-硫酸试剂可与戊糖、己糖、双糖（或寡糖）、多糖、糖醛酸起显色反应，己糖及其聚糖在480nm处（戊糖在480 nm）有最大吸收，吸收度值与浓度呈线性关系。
以葡萄糖做对照品测定葡萄糖和葡聚糖的回收率无显著差异，证明用葡萄糖和葡聚糖做为对照品测定多糖含量的结果是一致的，不需要换算系数。根据拓展的苯酚硫酸法的实验原理，该方法可测定糖的范围可拓展为各种单糖、双糖、寡糖、可溶性多糖和糖醛酸及其聚糖，包括还原糖和非还原糖，其中可溶性多糖指，各种多聚糖和聚糖醛酸，在水溶液中和水分子结合，形成高分子胶体溶液，所以该方法应用于各种可溶性多糖的含量测定更好。
苯酚硫酸法可以直接测定可溶性多糖含量，可溶性多糖无需水解成单糖，可以直接用本方法测定。说明GB/T15672-2009中关于多糖只有水解成还原糖才可与苯酚硫酸生成显色物质的原理全面性有待商榷。有文献用本方法测定多糖含量时，说糖醛酸和其他中性糖对多糖含量测定有干扰[25]，其原理不是干扰作用，苯酚硫酸法是广普性测定糖含量的方法，这些糖和可溶性多糖共存时，其测定结果是这些糖的含量之和，该方法不能分辨测定各种糖的含量。
单糖的显色能力差异会导致测定总糖含量的准确性[26]。此外，根据官能团不同，己糖还可分为醛糖和酮糖，而由于结构的相似性，在己糖中，苯酚硫酸法产生的反应会相对一致，这与本实验的研究结果相似[7,27,28]。对于杂多糖的单糖组成，有戊糖和己糖时[25]，用本方法测定多糖含量时要考虑戊糖和己糖的最大吸收波长不同，选择合适的波长和对照品，最大吸收波长不同其意义也不相同。
苯酚硫酸法作为检测总糖含量的主要方法之一，其应用于测定不同种类的多糖也变得更具挑战性[29]。本试验方法测定多糖，根据样品的处理方法，其测定结果的意义也不同，测定样品完全水解，测定的结果就是各种单糖数量之和，不水解直接测定的结果就是可溶性多糖含量。
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收稿日期：
基金项目：黑龙江省省属科研院所科研业务费项目（编号：CZKYF2023-1-B026）
作者简介：韩书昌（1964-），男，副研究员，研究方向：多糖成分研究，E-mail：hanshuchang640303@163.com；
付婷婷（1985- ），女，助理研究员，研究方向：食品加工，E-mail:futingting@126.com。
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