基于正交分析的紫罗兰蜜薯中花青素的提取及功能分析

　　

基于正交分析的紫罗兰蜜薯中花青素的提取及功能分析

Extraction and Functional Analysis of Anthocyanins from Violet Sweet Potato based on Orthogonal Design

刘翠翠^§，郭钰洁，李正浩，樊子扬，杨轶洋，王新光

（太原工业学院，山西 太原 030008）

LIU Cuiui, GUO Yujie, LI Zhenghao, FAN Ziyang, YANG Yiyang, WANG Xinguang

(Taiyuan Institute of Technology, Taiyuan 030008, China)

摘 要：紫罗兰蜜薯中富含花青素，本研究采用有机试剂浸提法提取紫罗兰蜜薯中的花青素。花青素实验室提取工艺的优化使用了单因素和L₉(3⁴)正交试验，并通过测定花青素对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力验证了花青素的抗氧化功能。结果表明，在本实验条件下，紫罗兰蜜薯中花青素最佳提取工艺为：乙醇质量浓度50%，原料：提取试剂比1∶30（g/mL），浸提时间45min，在此条件下花青素提取率为6.42%， 且花青素对DPPH自由基和ABTS自由基具有较强的清除能力。

关键词：紫罗兰蜜薯；花青素；单因素实验；正交试验；抗氧化活性

Abstract: Anthocyanins are secondary metabolites that widely existed in fruits and vegetables such as violet sweet potato，organic reagent extraction method was used to extract anthocyanins from violet sweet potato in this study. the extraction process was optimized by single factor experiments and L₉(3⁴) orthogonal test, and the antioxidant activity of the extracted anthocyanins was evaluated by measuring the scavenging ability of DPPH free radical and ABTS free radical. As showed in the results, the best extraction process of anthocyanin from sweet potato was: the concentration of ethanol was 50%, raw material to reagent ratio of 1:30 (g/mL), extract for 45min. The extraction rate of anthocyanin under these conditions was 6.42%, and the obtained anthocyanin had strong scavenging ability of DPPH hydroxyl radical and ABTS free radical.

Key words: violet sweet potato; anthocyanins; single factor experiment; orthogonal test; antioxidant activity

花青素，又称花色素是一种广泛存在于植物中、可溶于水、具有较强抗氧化潜力的酚类化合物，具有清除自由基^[1]、增强新陈代谢、保护视力^[2-4]、抗衰老^[5]、改善循环系统疾病^[6]等多种作用。近年来，花青素还被证明可应用于食用膜^[7]、生物标记^[8]、太阳能电池^[9,10]等新兴热门领域。因此，对花青素提取方法的研究具有实际意义。李治华^[11-15]等报道了溶剂浸提法、高速逆流色谱浸提法、微波辅助提取法、生物酶提取法、超声辅助浸提法等常用的提取花青素的方法，本研究选择紫罗兰蜜薯作为研究对象，利用有机溶剂浸提法，通过单因素实验和正交试验对紫罗兰蜜薯花青素的提取工艺进行优化，得到紫罗兰蜜薯中花青素提取的最佳工艺条件。此外，本研究利用提取到的花青素进行了DPPH自由基和ABTS自由基清除实验对花青素的相关功能进行了体外实验验证，为紫罗兰蜜薯中花青素的进一步研究、开发与利用提供了基本理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料

紫罗兰蜜薯：广西南宁(切成1-3mm薄片，60℃烘箱烘干后，用小型打粉机粉碎，收集通过50目筛子的粉末备用)；原花青素标准品：上海士锋生物科技有限公司（以下简称“士锋生物”）；DPPH：化学试剂总店；ABTS：士锋生物；盐酸、正丁醇、过硫酸钾、无水乙醇、甲醇、硫酸铁铵都是分析纯；可见分光光度计(723)：元析仪器；电子天平(FA224)：上海恒平；数显恒温水浴锅： HH系列-1型，青岛聚创世纪环保有限公司。

1.2实验方法

1.2.1绘制花青素标准曲线

配制花青素标准溶液（0.50mg/mL），分别取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL于容积是10mL的平底试管，各加甲醇到刻度为 1.0 处，然后加正丁醇-盐酸溶液(V95:V5) 到刻度为7.0处。用移液器分别加4%的硫酸铁铵溶液(现配) 0.1mL，摇匀后，置于60℃水浴中加热20min，快速冷却后记录530nm处的吸光值，用origin作图软件做标准曲线。

1.2.2花青素含量的测定

紫罗兰蜜薯中花青素得率：

花青素提取率%=cv/m×100%

式中，c为花青素溶液浓度(g/mL)，v为花青素溶液总体积(mL)，m为紫罗兰蜜薯干重(g)。

1.2.3单因素实验

1.2.3.1乙醇浓度对花青素得率的影响

称取5份1.0g的紫罗兰蜜薯粉末，分别置于烧杯中并加入20mL乙醇溶液（浓度为30%、40%、50%、60%、70%），静置30min后，过滤，各取滤液0.50mL于5支10mL平底试管中，再加入甲醇溶液至1.0 mL，然后加正丁醇-盐酸溶液到7.0mL，再加2%硫酸铁铵溶液(现配) 0.2mL，摇匀后，置于60℃水浴中加热20min，快速冷却后在530nm处测吸光值。

1.2.3.2料液比对花青素得率的影响

称取5份1.0g的紫罗兰蜜薯粉末，分别置于烧杯中并分别加入15mL、20mL、30mL、40mL、50mL 50%的乙醇溶液，静置30min后，过滤，各取滤液0.50mL于5支10mL平底试管中，加入甲醇溶液至1.0 mL，然后加入正丁醇-盐酸溶液到7.0mL，再加2%硫酸铁铵溶液(现配) 0.2mL，摇匀后，置于60℃水浴中加热20min，迅速冷却后在530nm处测吸光值。

1.2.3.3浸提时间对花青素得率的影响

称取5份1.0g的紫罗兰蜜薯粉末，分别置于烧杯中并分别加入20mL 50%的乙醇溶液，静置15min、25min、35min、45min、55min后过滤，各取上层液0.50mL于5个最大刻度是10mL的平底试管中，各加入甲醇溶液至1.0 mL，然后加入正丁醇-盐酸溶液到7.0mL，再加2%硫酸铁铵溶液(现配) 0.2mL，摇匀后置于60℃水浴加热20min，迅速冷却，在530nm处测吸光值。

1.2.4正交试验

根据单因素实验结果，以花青素得率作为指标，设计L₉(3⁴）正交试验，优化紫罗兰蜜薯中提取花青素的条件。

表1 因素水平表

水平	因素
	A原料：提取剂比/（g/mL）	B乙醇质量浓度/%	C浸提时间/min
1	1:20	30	15
2	1:30	50	35
3	1:40	60	45

1.2.5花青素对DPPH自由基的清除作用

参考古荣鑫等^[16-18]的方法，准确吸取花青素溶液(浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/mL)各1mL，分别与0.2mmol·L^-1的DPPH溶液1mL混合，充分摇匀后放置30min。记录517 nm 处吸光值为A₁。

准确吸取样品(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/mL)各1mL，加1mL去离子水，充分摇匀后放置30min。记录517nm 处吸光值为A₂。

准确吸取0.2mmol·L^-1的DPPH溶液1mL，加1mL去离子水，充分摇匀后放置30min。在上述波长处测定吸光度值，记为A₀。

清除率计算:

清除率(%)=[1-(A₁-A₂)×A₀^_1]×100%

式中，A₁为样品的吸光值，A₂为对照组的吸光值，A₀为空白组的吸光值。

1.2.6花青素对ABTS自由基的清除作用

参考叶宏宇、张海霞等的方法^[19,20]，分别量取0.2mL 7.4mmol×L^-1 ABTS和2.6mmol×L^-1(NH₄)₂S₂O₈，混合均匀。在黑暗中静置14小时后用酒精稀释以上ABTS自由基母液，直到吸光值为0.70±0.02（波长734 nm）。

精确吸取0.8mL ABTS自由基工作液与0.2mL样品溶液(浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/mL)，振摇10s，充分混合后静置6min，记录样品组的吸光值为A（波长734nm）。

精确吸取0.8mL ABTS自由基工作液与0.2mL 95%乙醇溶液，振摇10s，充分混合后静置6min，记录上述波长下空白对照组的吸光值为A₀。

清除率计算:

清除率(%)=[A₀-A/A₀]x100%

2结果与分析

2.1标准曲线

横坐标选原花青素标准液的浓度，纵坐标选吸光值，绘制标准曲线。由图1可以看出，花青素在(0-0.5）×10^_3g×1×10^-3L范围之间拟合的线性良好，回归方程为Y=0.496X+0.0017，R²=0.9995，可以用于花青素浓度的计算。

2.2单因素试验

2.2.1乙醇液浓度对花青素得率的影响

由图2可知，当乙醇选用50%浓度时，花青素的最佳得率为3.06%。

2.2.2料液比对花青素得率的影响

由图3可知，得率随着原料：浸提液体积比值的增加而先升后降，在比值为1:20时，花青素最佳得率为2.8%，在料液比为1:30时花青素得率为2.79%。

2.2.3浸提时间对花青素得率的影响

由图4可知，花青素得率在浸提时间为35min时，花青素最佳得率为2.8%。

2.3正交试验优化花青素提取工艺

根据上述三个实验进行正交试验设计，设计组合和结果见表2，由表2可知在料液比1:20，乙醇浓度50%，浸提时间45min条件下，花青素得率最大为6.35%。

表2 正交设计及结果

实验号	A料液比 /g/mL	B乙醇浓度 /%	C浸提时间 /min	花青素得率 /%
1	1:40	60	25	3.02
2	1:20	50	45	6.35
3	1:40	30	45	3.72
4	1:20	60	35	3.68
5	1:30	60	45	2.29
6	1:40	50	35	2.52
7	1:30	50	25	3.99
8	1:30	30	35	6.15
9	1:20	30	25	1.24
K1	11.27	11.11	8.25
K2	12.43	12.86	12.35
K3	9.26	8.99	12.36
k1	3.76	3.70	2.73
k2	4.14	4.29	4.12
k3	3.09	3.00	4.12
R	1.05	0.59	1.39

在本研究的实验条件下，对紫罗兰蜜薯中花青素提取影响最显著顺序是浸提时间>料液比>乙醇浓度，且最佳浸提工艺为：料液比为1:30、乙醇浓度50%、浸提时间45min。为了验证正交试验优选工艺的准确性，在推荐工艺下进行了一组实验，结果花青素的得率为6.42%，大于6.35%，说明该工艺为本实验条件下的最佳工艺。

2.4提取液对DPPH自由基的清除作用

用最佳工艺条件提取的花青素溶液进行功能验证实验。由图5可知，花青素浓度正相关于其对DPPH的清除，且最高可达到96.97%。

2.5提取液对ABTS自由基的清除作用

如图6所示，花青素对ABTS自由基的清除率与其浓度正相关，且最大清除率可达到37.19%。

3结论

本研究通过单因素实验确定了三因素三水平L₉(3⁴)正交设计优化紫罗兰蜜薯中花青素的提取工艺，最终得出紫罗兰蜜薯中花青素的最佳提取工艺为：时间45min、料液比1:30、乙醇浓度50%，且在此条件下花青素得率为6.42%。其中，花青素得率受料液比的影响最大、浸提时间影响最小。功能实验证明紫罗兰蜜薯中提取的花青素对DPPH、ABTS自由基有清除作用，且与花青素的浓度正相关。试验结果为紫罗兰蜜薯中花青素的进一步研究奠定了基础。

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