【摘要】目的：采用高效液相色谱法测定头孢曲松钠聚合物的含量，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，测定头孢曲松钠中聚合物含量，并进行方法验证。方法： 0.02moL/L正辛胺溶液：乙腈=73：27，pH值（磷酸调节）6.5为流动相A，流动相B为乙腈，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长254nm，采用梯度洗脱的方式进行实验。结果：该方法专属性、检测限和定量限、精密度、线性、耐用性等参数符合要求。结论：该方法可用于测定头孢曲松钠聚合物含量，准确度和灵敏度高。
【关键词】头孢曲松钠；聚合物；高效液相色谱仪
High Performance Liquid Chromatography Determination of Ceftriaxone Sodium Polymer
Bao Nannan1,2,3,4, Gong Haixue1,2,3,4, Sun Yushuang1,2,3,4, Biao Yanan1,2,3,4, Yang Xuan1,2,3,4
(1.North China Pharmaceutical Hebei Huamin Pharmaceutical Co.,Ltd,Shijiazhuang 052165; 2.National and Local Joint Engineering Laboratory of Antibiotic Enzyme Catalysis and Crystallization Technology,Shijiazhuang 052165;3.Hebei Cefosporin Drug Preparation Technology Innovation Center,Shijiazhuang 052165;4.North China Pharmaceutical Hebei Huamin Pharmaceutical Co., Ltd., Hebei Enterprise Technology Center,Shijiazhuang 052165)
Abstract Objective:To determine the content of cephalosporin sodium polymer with high -efficiency liquid chromatography, the chromatography column uses ectumane silicane bonds silicone as the filling agent to determine the content of cephalosporte sodium polymer content, and verify the method to verify the method to verify the method. Essence Method: 0.02 mol/L
作者简介：鲍楠楠，女，本科，从事药物质量研究。
通信作者：巩海雪，女，本科，从事药物质量研究。
positive amine solution: acetylene = 73: 27, pH value (regulating) 6.5 is flow phase A, flow phase B is acetylene, the flow velocity is 1.0ml/min, the column temperature is 30 ° C, the detection wavelength is detected wavelength, the wavelength detection wavelength is detected. 254nm, experiments were used to eluted by gradient elution. Results: The specific attribute, detection limit and quantitative limit, precision, linear, durability and other parameters of this method meet the requirements. Conclusion: This method can be used to determine the content of spores and sodium polymer, high accuracy and sensitivity.
Key words:ceftriaxone sodium;polymer;high performance liquid chromatography
头孢曲松为第三代头孢菌素类抗生素，通过抑制细菌的细胞壁合成而起作用的杀菌剂，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性具有高效杀菌作用[1-2]。头孢曲松为半合成头孢菌素,研究表明，β-内酰胺类抗生素引发的速发型过敏反应并非药物本身所致，而是与药物中存在高分子聚合物有关[3-5]。因此，对高分子聚合物的控制很有必要。2020版《中国药典》（二部）[5]中对头孢曲松钠检测聚合物总量，使用葡萄糖凝胶Sephadex G-10色谱柱的凝胶色谱法，对该品种工艺中产生的各聚合物并不能很直观的进行分析，为了观察华北制药河北华民药业有限责任公司工艺下的头孢曲松钠原料药中可能存在的各聚合物的变化及总聚合物的变化，进行了方法开发及验证工作，本方法中共涉及4个聚合物峰，总聚合物的量为4个聚合物之和。
方法中系统适用性溶液需要在室温下放置24h-72h，保证系统适用性溶液中聚合物1、聚合物2、聚合物3、聚合物4峰有效分离，该条件已进行验证，见色谱图1-2：
色谱图1：系统适用性溶液在室温下放置24h
Fig.1System applicable solution is placed 24h at room temperature
色谱图2：系统适用性溶液在室温下放置72h
Fig.2System applicable solution is placed 72h at room temperature
在进行方法试验过程中，将待测物用未经过过滤的溶剂溶解后，使用孔径为0.45μm的滤膜过滤，检测结果出现异常，待测物峰并未按照要求出现正常峰，推测滤膜将待测物阻断，即出现滤膜吸附现象，针对这一猜测，进行了验证试验，方法如下：
选取对照品溶液经孔径为0.45μm的滤膜过滤，直接进样进行测试，结果：在该方法下，对照品溶液未出现目标峰（见色谱图3）；另取同一份对照品溶液经孔径为0.45μm的滤膜过滤，弃去2ml初滤液，采用中间过滤溶液，进行检测，结果：在该方法下，出现目标峰，但，由色谱图可直观看到，目标峰响应值远远小于要求值（见色谱图4）；最后重新称量与之前对照品溶液中差异不大的对照品，将溶剂经过孔径为0.45μm的滤膜过滤，使用该过滤后的溶剂溶解对照品，使之浓度与之前对照品溶液基本一致，取该对照品溶液进行测试，结果：在该方法下，出现目标峰，且目标峰响应正常（见色谱图5）。由此，证实了推测，即孔径为0.45μm的滤膜对该方法下的待测物有吸附作用，因此，本方法中需要检测的溶液均需要使用提前被孔径为0.45μm的滤膜过滤后的溶剂溶解，制备待测溶液后不可再进行过滤。
色谱图3：经孔径为0.45μm的滤膜过滤的对照品溶液
Fig.3A controlled solution filtered by filter membrane filter with 0.45μm diameter
色谱图4：经孔径为0.45μm的滤膜过滤的取中间段过滤液的对照品溶液
Fig.4A controlled solution of the intermediate section filtering solution with a filter filter with 0.45 μm
色谱图5：使用经孔径为0.45μm的滤膜过滤的溶剂稀释的对照品溶液
Fig.5A controlled solution diluted with a solvent diluted with a solvent filtered with a diameter of 0.45 μm
1.仪器与试药
1.1仪器
岛津高效液相色谱仪：型号LC-2040C、LC-20A；安捷伦高效液相色谱仪：型号AgiLent1260；梅特勒托利多百万分之一电子天平：型号XPR26；重庆永生实验仪器厂药品强光试验箱：型号SHH-300GD-2；天津泰斯特电热恒温水浴锅：型号DK98-Ⅱ；梅特勒托利多PH计：型号FE20。
1.2试药
头孢曲松钠（验证采用华北华民药业有限责任公司生产）、正辛胺（分析纯，阿拉丁）、磷酸（分析纯，阿拉丁）、盐酸（分析纯，天津风船）、氢氧化钠（分析纯，天津光复），30%过氧化钠（高级纯，国药集团）、乙腈（色谱纯，默克）。
2.方法与结果
2.1色谱条件：
流动相：A：0.02moL/L正辛胺溶液-乙腈（73：27），磷酸调节pH值至6.5；流动相B：乙腈；
色谱柱：CapceLL Pak MGII，4.6mm×250mm，5μm；波长254nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min
洗脱梯度按照表1进行：
表1：洗脱梯度
Tab.1Eluing gradient
时间/min | A% | B% |
0 | 100 | 0 |
5 | 100 | 0 |
41 | 73 | 27 |
41.1 | 100 | 0 |
50 | 100 | 0 |
系统适用性实验：取1μL系统适用性溶液注入液相色谱仪，记录的色谱图应与系统适用性溶液典型色谱图基本一致，聚合物峰1、2、3、4依次出峰。
样品测定：精密取上述供试品、对照品溶液各20μL，液相色谱仪进行检测。按自身对照法以峰面积计算头孢曲松聚合物的含量。
典型色谱图见图6：
色谱图6：典型色谱图
Fig.6：Typical chromatogram
（注：色谱峰1、2、3、4为聚合物峰，相对保留时间分别为1.88、2.16、2.32、2.35，聚合物峰的相对保留时间可在所列保留时间的±10%范围内。）
2.2样品溶液配制：
空白溶液/稀释剂：水-乙腈（73：27）
系统适用性溶液：取本品约0.5g，置10ml量瓶中，加水-乙腈（73：27）定容，室温静置24-72小时，制得系统适用性溶液。供试品溶液：取本品约22mg，避光，置100ml容量瓶中，以水-乙腈（73：27）定容。
对照品溶液：精密量取供试品溶液1mL，置于100mL量瓶中，用水-乙腈（73：27）稀释至刻度，摇匀。
2.3专属性
2.3.1定性实验
按2.2项下配制空白溶液、系统适用性、对照品、供试品溶液，按2.1项下色谱条件检测。结果见表1。
表2 头孢曲松钠定性试验结果
Tab.2 Qualitative test results of ceftriaxone sodium
样品 | 杂质名称 | RT（min） | RRT | 分离度 | 峰纯度 |
系统适用性 | 聚合物1 | 23.338 | 1.85 | 1.0、4.0 | 999.969 |
聚合物2 | 26.650 | 2.11 | 2.2、4.2 | 999.961 | |
聚合物3 | 29.173 | 2.31 | 4.2、0.5 | 999.890 | |
聚合物4 | 29.523 | 2.34 | 0.5、1.8 | 999.541 | |
主峰 | 12.607 | N/A | 1.6、2.7 | N/A | |
供试品溶液 | 聚合物1 | 23.385 | 1.83 | 1.1、N/A | 997.853 |
聚合物2 | 未检出 | N/A | N/A | N/A | |
聚合物3 | 未检出 | N/A | N/A | N/A | |
聚合物4 | 未检出 | N/A | N/A | N/A | |
主峰 | 12.767 | N/A | 5.8、5.4 | N/A |
结果显示，系统适用性溶液中各聚合物峰达到有效分离，相对保留时间典型图谱要求基本一致；供试品溶液中未检出聚合物2、聚合物3、聚合物4，供试品溶液中聚合物1的相对保留时间符合要求，聚合物1与前后峰达到有效分离。2.3.2破坏实验
破坏实验样品溶液配制见表3：
表3 破坏试验样品配制
Tab.3 Destruction test sample preparation
条件 | 样品配制 |
未破坏 | 精密称取供试品22mg，置100mL量瓶中，避光，加水-乙腈（73：27）定容。 同法制备空白溶液。 |
酸破坏 | 精密称取供试品22mg置100ml量瓶中，加盐酸溶液（5ml 1mol/L），室温放置30min后，再加氢氧化钠溶液（5ml 1mol/L），加水-乙腈（73：27）定容。 同法制备空白溶液。 |
碱破坏 | 精密称取供试品22mg，置100mL量瓶中，加氢氧化钠溶液（1ml 1mol/L）破坏2min，再加盐酸溶液（1ml 1mol/L），加水-乙腈（73：27）定容。 同法制备空白溶液。 |
高温破坏 | 精密称取供试品22mg，置100mL量瓶中，加10ml水-乙腈（73：27）溶解，置于85℃高温水浴中破坏10min，放至室温，加水-乙腈（73：27）定容。 同法制备空白溶液。 |
氧化破坏 | 精密称取供试品22mg，置100mL量瓶中，加2ml 30%双氧水溶液破坏1min，加水-乙腈（73：27）定容。 同法制备空白溶液。 |
光照破坏 | 精密称取供试品22mg，置100mL量瓶中，加水-乙腈（73：27）定容后，强光照射破坏30h。 同法制备空白溶液。 |
经试验验证样品分别在光破坏、酸破坏、碱破坏、氧化破坏、高温破坏条件下，聚合物峰分离度良好，破坏程度、物料平衡及峰纯度见表3，其中R1为头孢曲松聚合物1与相邻杂质峰分离度；R2为头孢曲松聚合物2与相邻杂质峰分离度；R3为头孢曲松聚合物3与相邻杂质峰的分离度；R4为头孢曲松聚合物4与相邻杂质峰分离度；R5为头孢曲松与相邻杂质峰分离度。
表4 专属性破坏试验结果
Tab.4Vital destruction test results
试验条件 | 未破坏 | 酸破坏 | 碱破坏 | 氧化破坏 | 光照破坏 | 高温破坏 | |
破坏程度/% | N/A | 91.3 | 86.2 | 80.6 | 89.9 | 81.6 | |
物料平衡/% | N/A | 94.2 | 97.6 | 95.8 | 96 | 92.6 | |
峰纯度因子 | R1 | 997.853 | 998.554 | 998.678 | 997.627 | 998.286 | 999.793 |
R2 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 997.228 | 998.247 | |
R3 | 未检出 | 未检出 | 997.617 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | |
R4 | 未检出 | 未检出 | 995.207 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | |
R5 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | |
结果表明，各破坏条件下，破坏程度均在80%～90%范围；破坏前后物料守衡；各破坏条件下空白溶剂对聚合物1、聚合物2、聚合物3、聚合物4测定无干扰；各聚合物峰峰纯度均大于990。该方法专属性良好。
2.4检测限和定量限
2.4.1检测限
精密称定头孢曲松对照品22mg，置100mL容量瓶，加水-乙腈（73:27）定容；精密量取1mL，置100mL容量瓶，用水-乙腈（73:27）定容。精密量取1mL，置200mL容量瓶，用水-乙腈（73:27）定容，作为检测限溶液。取检测限溶液20μL按照2.1色谱条件进行测定，头孢曲松峰信噪比3:1为标准。结果：当头孢曲松浓度为9.39ng/mL，相当于供试品浓度的0.0050%，检测限为188μg，信噪比5.24：1。
2.4.2定量限
精密称定头孢曲松对照品22mg，置100mL容量瓶，加水-乙腈（73:27）定容；精密量取1mL，置100mL容量瓶，用水-乙腈（73:27）定容。精密量取1mL，置100mL容量瓶，用水-乙腈（73:27）定容，作为定量限溶液。取定量限溶液20μL按照2.1色谱条件进行测定，头孢曲松峰信噪比10:1为标准。结果：当头孢曲松浓度为18.79ng/mL，相当于供试品浓度的0.010%，定量限为376μg，信噪比15.74：1，6针定量限溶液重复性峰面积RSD值为6.31%。
2.5线性和范围测试
按照头孢曲松钠聚合物≤0.5%为标准，测定头孢曲松定量限（LOQ）～400%的线性关系。
线性溶液按照以下进行配制：称取头孢曲松对照品约22mg，精密称定，置100ml量瓶，加稀释剂定容，摇匀，作为线性贮备液；精密量取线性贮备液0.1ml、0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml分别置100ml量瓶中加稀释剂定容，分别得到20%、40%、100%、200%、300%、400%的各浓度的线性溶液。取2.4.2项下的定量限溶液及各浓度线性溶液按照2.1项下色谱条件检测。线性测定结果以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。
测定结果见图7：
图7头孢曲松线性图
Fig.7 Linear graph of ceftriaxone
2.6精密度
2.6.1重复性试验
操作员使用型号为LC-2040C的岛津高效液相色谱仪按2.6.1项下配制空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液及供试品溶液，其中供试品配制6份，测定6份供试品溶液中聚合物的量，对比RSD值。结果：6份聚合物含量的相对标准偏差为4.02%，方法重复性良好。
2.6.2中间精密度
由另一位操作员使用Agilent1260高效液相色谱仪，重复2.6.1重复性试验下操作，测定供试品中聚合物的量，与2.6.1重复性实验中6份供试品中聚合物的量进行对比。结果：12份聚合物含量的相对标准偏差为9.39%。方法中间精密度良好。
2.7耐用性
方法考察其耐用性情况，通过改变部分色谱条件：通过改变流速（1.2mL/min与0.9mL/min）、柱温（25℃和35℃）、乙腈比例（26.5%与27.5%）、流动相A的PH（6.3与6.7）、波长（252nm与256nm）及不同色谱柱考察。结果表明：各条件下，系统适用性记录的色谱图应与系统适用性溶液典型色谱图基本一致，聚合物峰1、2、3、4依次出峰，相对保留时间分别为1.88、2.16、2.32、2.35，聚合物峰的相对保留时间在所列保留时间的±10%范围内；各条件下聚合物含量的RD值最大为0.04%，方法耐用性良好。
2.8供试品测定结果
取三批样品，按照上述测定方法进行测定，测定聚合物含量结果为0.08%、0.10%、0.08%。
3. 结论
方法考察了对照品溶液和供试品溶液在常温下和4℃下的稳定性，结果：供试品溶液在4℃条件下，14.2小时内稳定，聚合物含量变化的RD≤10.0%；在室温条件下，不稳定，聚合物含量变化的RD＞10.0%；对照品溶液在4℃条件下，25小时内稳定，峰面积的RSD为0.84%；在室温条件下，13.3小时内稳定，峰面积的RSD为1.19%。
方法参考中华人民共和国中国药典（2020年版二部）[6]（306页头孢曲松聚合物）中对头孢曲松钠聚合物含量的控制，限度设定含头抱曲松聚合物的量不得过0.5% 。方法验证项参考中华人民共和国中国药典（2020年版四部）[7]中（9101药品质量标准分析方法验证指导原则480-483页）的要求进行验证。验证结果表明本方法准确度和灵敏度等良好，可用于头孢曲松钠聚合物测定。
参考文献
[1]朱小明,陈百晔.1例头孢曲松致剧烈腹痛用药分析[J].临床普外科,2023，11（4）：54-55.
[2].杨霞 注射用阿奇霉素对儿童肠道菌群影响的临床研究[C]. 《沈阳医学院硕士论文》2021.05.01
[3]乔海灵，赵永星，马统勋.青霉素抗生素过敏反应机制及诊断的新近研究进展[J].国外医药,抗生素分册，2002，23（5）:197
[4]胡昌勤，金少鸿.自身对照外标定量法测定β-内酰胺类抗生素中高分子杂质[J].中国抗生素，1997.22（1）：23
[5]袁雯玮.高分子聚合物研究与《中国药典》2005版β-内酰胺类抗生素高分子聚合物修订情况及操作要点[J].中国抗生素，2005,30（12）:727
[6] 张鹏，申明睿，李浩，等.中华人民共和国中国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2020（2）：306.
[7] 张鹏，申明睿，李浩，等.中华人民共和国中国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2020（4）：480-483.
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