重组胶原蛋白制备工艺研究进展

　　

重组胶原蛋白制备工艺研究进展

刘英杰，徐荣荣，苏淮，王啸尘，王艺纯，黄伟，杨素珍^*

（山东福瑞达生物股份有限公司，山东 济南 250101）

摘要：胶原蛋白是一种生物功能蛋白，广泛应用于生物医学、化妆品护肤、食品、新型材料等诸多领域。重组胶原蛋白因其避免了免疫反应，且产量和性能稳定，具有替代动物提取胶原蛋白的巨大潜力。然而，重组胶原蛋白在工业应用中仍面临着表达量低、工业生产成本高和羟化难等挑战。重点阐述了重组胶原蛋白发酵过程中影响产量的关键因素，结合国内外的实验研究，得出每个关键因素适宜的控制条件；介绍了重组胶原蛋白纯化过程常用的制备工艺及机理，并结合实例探讨了每种工艺对提取重组胶原蛋白的实际效果；最后对重组胶原蛋白的发酵和纯化工艺的优化进行了展望。

关键词：重组胶原蛋白；发酵工艺；提取工艺；优化

Research progress on preparation technology of recombinant collagen

LIU Yingjie,XU Rongrong,SU Huai,WANG Xiaochen,WANG Yichun,HUANG Wei,YANG Suzhen*

(Shandong Freda Biotech Co., Ltd, Jinan 250101, China)

Abstract: Collagen is a biofunctional protein that has been widely used in many fields, including but not limited to biomedical, cosmetics and skin care, food, and novel materials.Recombinant collagen has great potential as an alternative to collagen extracted from animals because it avoids the immune response, also the yield and properties are stable.However, recombinant collagen still faces challenges in industrial applications such as low expression,high cost in industrial production and difficult hydroxylation.This paper focuses on the key factors affecting the yield of recombinant collagen fermentation,and obtains the appropriate control conditions for each key factor based on the domestic and foreign experimental researches.The common preparation technology and mechanism of recombinant collagen purification process were introduced, and the practical effect of each process on the extraction of recombinant collagen was discussed with examples.Finally,the optimization of fermentation and purification process of recombinant collagen was prospected.

Key words: recombinant collagen; fermentation process; extraction process；optimize

胶原蛋白（或称胶原）是一种普遍存在于哺乳动物体内的大分子蛋白质，约占体内蛋白质总量的25～35%^[1-2]；人体内，主要存在于皮肤、骨骼、软骨、韧带和血管中，是结缔组织中极其重要的结构蛋白质，在结缔组织中发挥连接、支持、营养供给和保护等作用^[3]。胶原蛋白因其生物相容性好、体内可降解、透水透气性好等特性^[4]，目前广泛应用于生物、 医药、美容、食品等领域^[5]。胶原蛋白的获取方式归为两类：一类是从猪骨、牛皮等动物组织中提取；另一类是采用底盘细胞构建的方式获得，采用此方式获得的胶原蛋白称为重组胶原蛋白。现如今，随着合成生物学技术不断发展，制备方法逐渐趋向于采用底盘细胞构建的方式制备。制备工艺如图1所示。天然胶原蛋白与重组胶原蛋白理化性质对比见表1。

表1 重组胶原蛋白和天然胶原蛋白对比

类型	重组胶原蛋白	天然胶原蛋白
主要生产方式	高密度发酵	化学提取法
来源/资源	细胞蛋白/不受限	动物组织/受限
制备成本	原材料成本低，具备规模效应；一次性设备成本高	原材料成本高，一次性设备成本低
安全性	无病毒隐患	易携带动物病毒（疯牛病等）
排异反应	同质蛋白，反应低[6]	异源蛋白，反应高[7]
水溶性	溶于水	不溶于水
变性温度	高，有的高达72 ℃	低，37~40 ℃
纯度	单一组分，纯度达95 %	混合胶原，成分复杂
全生产周期	短	长
代表企业	巨子生物，锦波生物，创健医疗	台湾双美生物，长春博泰医药生物，创尔生物

图1 重组胶原蛋白生产工艺^[1]

Fig.1 Production process of recombinant collagen^[1]

近期，胶原蛋白行业内主流生产商包括巨子生物、锦波生物、创尔生物及聚源生物均进行产能扩张计划，行业产能瓶颈突破，将进一步推进胶原蛋白产业化进程，提高行业产业化确定性，助推行业整体快速发展。 2022年11月4日，西安巨子生物基因技术股份有限公司正式在港交所主板上市，成为港股“胶原蛋白第一股”。2023年7月20日，山西锦波生物在北京证券交易所上市，成为北交所“重组胶原蛋白第一股”。1981年，全球首款牛胶原蛋白植入剂获美国FDA 批准上市，但始终存在免疫原性的产业瓶颈；2021年，锦波生物率先开发出全球首款人源化胶原蛋白注射剂—重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维，标志着胶原蛋白从动物提取时代跨越到生物合成时代，突破了传统胶原蛋白的免疫原性。综上，近年来重组胶原蛋白多家龙头积极扩大产能（产业化）、多家公司上市（资本化）和锦波生物突破胶原蛋白的免疫原性（关键技术）三方面均有突破，未来替代天然胶原蛋白和透明质酸市场可期。

本文首先对重组胶原蛋白的发酵条件优化的方向和内容进行总结归纳，再对常用的纯化技术并结合实例进行详细说明，最后对重组胶原蛋白下游工艺前景进行展望。

1发酵篇

为了使重组胶原蛋白更快地实现产业化规模，现主要的研究重点是发酵和纯化工艺的优化，一方面是增加发酵产量，另一方面是降低生产成本，力求达到降本增效的目标。为了提高重组胶原蛋白的发酵产量，国内研究人员进行了大量的实验探究。纵观历年关于重组胶原蛋白相关的硕博士论文及中外期刊杂志，优化条件主要包括：改变甲醇添加量，调整不同溶氧大小，控制不同比生长速率，改变诱导条件和强度，分批和补料培养基碳氮比，补料速率，控制残糖浓度和残留甘油浓度等十几种方式。

1.1诱导因素

目前已有两种微生物表达系统被用于生产重组胶原蛋白，分别是大肠杆菌^[8]和毕赤酵母^[9]。这两类底盘细胞在表达重组蛋白时常采用以下两种诱导方式：分别为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导和温度诱导。由于IPTG不被菌体代谢，为乳糖类似物，持续稳定，诱导效率高，一直以来受到广大科研工作者的喜爱^[10]。诱导的原理：IPTG通过与细菌中的一种特殊转录因子，即乳糖操纵子阻遏蛋白（LacI蛋白）结合。当IPTG与LacI结合时，会改变LacI的结构，使其失去抑制作用，从而使特定基因的转录和表达得以发挥^[11]。当然不同的诱导时机和诱导剂量也会直接影响胶原蛋白的表达。

李瑛琦^[12]等采用基因工程法，构建重组大肠杆菌底盘细胞表达胶原蛋白。在7L发酵罐中加入IPTG诱导表达重组胶原蛋白，最终重组胶原蛋白发酵产量最高可以达到3.02 g/L。杨晶^[13]等采用合成生物学的方法PCR扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽片段，与载体 pET 28a 连接后，在大肠杆菌底盘细胞中进行表达，过程中添加 IPTG 诱导，并优化IPTG诱导条件，控制诱导剂浓度在0.4 mmol/L时，重组类人I型胶原蛋白表达量最高。

何会霞^[14]研究了在不同诱导时机（对数生长前期：OD₆₀₀~2.5、中期：OD₆₀₀ ~5.5和末期OD₆₀₀ ~9.5）加入相同浓度（1mM）的IPTG对大肠杆菌生长和重组胶原蛋白表达的影响。结果显示：当重组菌处于对数生长期的后期进行诱导表达，菌体湿重最大，但中期进行诱导表达，目标蛋白表达量最高。

IPTG是一种对细胞有毒的成分，在发酵过程中过早的加入至培养基，菌体的生长繁殖会受到负面影响，导致生物量减少，在相同的发酵时间内收获的胶原蛋白就会减少；过晚添加诱导剂，菌体已处于稳定生长阶段，发酵液中培养基的浓度也比较低，细胞代谢速度减缓，表达量也会减少^[15-16]，因此，在实际发酵生产中，常常去寻找菌体生长量和蛋白表达量之间的平衡点，力求达到最大的生产效率。

齐静静^[17]等研究了不同IPTG浓度对C．glutamicum ATCC 13032/p XMJ19-PorB-V-B表达的影响，把胶原蛋白表达量作为检测指标。在菌体OD₆₀₀=6时，加入终浓度为0.2，0.5，0.8，1.1mmol/L的IPTG，结果显示不同IPTG诱导浓度下，对菌体整体生长趋势无明显影响，IPTG浓度为0.5mmol/L时，胶原蛋白条带最粗，表达量最高。诱导剂量偏高会造成菌体代谢压力大从而导致蛋白表达量降低。

现有研究发现，重组胶原蛋白表达常常将毕赤酵母GS115作为一种常用的工程菌，它表达重组蛋白的关键是加入甲醇诱导氧化酶启动子^[18]。宗敏^[4]利用电穿孔转化，将pPICZα A/ COL 3A1导入毕赤酵母工程菌中，进行甲醇诱导表达，成功获得重组人III型胶原蛋白。梁鑫^[19]等采用15L发酵罐进行毕赤酵母发酵重组人Ⅲ型胶原蛋白，在甲醇诱导阶段，通过控制流加甲醇量，保证发酵液中含有四种不同浓度的甲醇，分别是0.05%、0.1%、0.2%、0.4%，经多批次发酵实验对比后得出结论：甲醇浓度维持在0.2%时，胶原蛋白表达量达从3 g•L^-1提高到8 g•L^-1。从上述实验中可以看出控制甲醇恒定的浓度可明显提高该蛋白的表达量。钮小松^[20]使用布里斯托培养基（BMM培养基）重悬培养好的基因工程菌毕赤酵母GS115，在培养箱中进行蛋白的诱导表达，设定温度为30 ℃，转速为220rpm，每24 h分别按0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%六个添加量水平补加甲醇，共诱导表达120 h，发现每24 h添加2.0%的甲醇诱导表达蛋白时，类人胶原蛋白的表达量最高。蔡思泽^[21]等为了提高重组胶原蛋白的发酵产量，对甲醇的浓度和补加的方式进行了优化，在诱导过程控制甲醇体积分数共有五个水平，分别是0.25%、0.25% （每12 h 补充一次）、0.5%，1%和 2%共五个水平，诱导表达72 h，结果表明：将甲醇浓度控制在0.5%时，重组胶原蛋白表达量最高可以达到0.45 g/L。

从以上实验结果发现：重组胶原蛋白在表达过程中，控制甲醇浓度对提高重组胶原蛋白的产量及其重要。甲醇作为一种发酵常用碳源，本身对酵母细胞有一定毒害作用，若发酵液中浓度过高，可能会导致细胞酶促反应速度加快，呼吸强度加强，必然导致细胞的衰老提前。另一方面的对菌体的毒害作用会导致细胞的活力下降，表达重组蛋白的能力收到抑制。反之如果甲醇补充的过少，抑制了毕赤酵母等细胞的繁殖，不利于外源基因的启动诱导表达，重组胶原蛋白的表达量就会减少^[22-23]。

如果制备的重组胶原蛋白具有生物活性，且用于医药领域，则不能使用IPTG化学诱导策略。温度诱导因其方便操作且成本低廉也常被用于工业发酵中^[23]，。为保证菌体正常生长和高效的蛋白合成，基因工程菌采用温度诱导，常常采取两个阶段的诱导方式。

赵强^[24]在125 L发酵罐中对两种温度诱导类人胶原蛋白的方式进行了探究。第一种是在诱导表达蛋白之间控制发酵温度为34 ℃，诱导至发酵结束阶段控制温度在42 ℃；第二种是菌体在对数生长中后期之前控制发酵温度是34 ℃，菌体处于对数生长中后期，将温度调整至42 ℃诱导一段时间后再调整至39 ℃直至发酵结束。结果是：采用第一种诱导方式，目的蛋白表达浓度达到12.58 g/L，采用第二种诱导方式目的蛋白的表达浓度为10.36 g/L，比第一种方式降低了21.43%。第一种诱导方式对细胞后续的生长造成了一定的压力，第一种诱导方式下罐时的菌体量仅为第二种诱导方式的87.83%，原因是长时间高温（42 ℃）诱导会造成细胞内的酶活性大幅降低，造成下罐时发酵液中OD₆₀₀值低于其他正常值，而且罐内表达的重组胶原蛋白浓度也偏低。

1.2溶氧浓度

溶氧（DO）是限制大肠杆菌高密度发酵的一个关键因素, 不适宜的溶氧水平会对菌体代谢产生影响, 从而影响目的产物的积累^[25]。在重组胶原蛋白的发酵生产中，有以下4种条件会影响溶氧大小，分别是：通气量、搅拌转速、温度和压力，通气量是其最主要影响因素。

常海燕^[26]等采用大肠杆菌研究了不同溶氧浓度对生产类人胶原蛋白Ⅱ的的影响，控制发酵温度34 ℃，比生长速率为0.25 h^-1，研究了溶氧分别为10%，20%，30%，40%时类人胶原蛋白的表达量，结果显示DO为20%，细菌密度和类人胶原蛋白Ⅱ浓度最高，分别达到 83.9 g/L 和 13.4 g/L。刘超^[27]等在摇瓶阶段研究了新构建的重组毕赤酵母 GS115/pPIC9K-AOX1-N-HC3240 菌株在不同溶氧对OD₆₀₀和蛋白表达的影响。利用三角瓶中是否存在挡板和装液量不同设置不用的溶氧水平。当500 mL 三角瓶中装50 mL 培养基时，诱导表达蛋白72 h，N-HC3240 的最高发酵产量达到0.12 mg/mL，比500 mL三角瓶种装 100 mL 培养基这种方式诱导表达的蛋白表达量高且达到最高表达量的时间缩短了24 h，表明500 mL三角瓶中装50 mL培养基摇瓶内溶氧效果最好。

1.3比生长速率

比生长速率对细胞生长和产物形成均有重要作用^[28]。大肠杆菌发酵过程中常将比生长速率控制在0.2 h^-1以内，这样做的优势主要包含两个方面：1. 将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2. 已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。

赵强^[24]研究了大肠杆菌细胞发酵表达类人胶原蛋白过程中不同比生长速率对菌种生长和类人胶原蛋白表达情况的差异。诱导前采用四种方式控制补料比生长速率，分别为0.10、0.15、0.20、0.25 h^-1，诱导后比生长速率控制在0.06-0.08 h^-1之间。结果发现：当比生长速率控制在0.15 h^-1时，OD₆₀₀和类人胶原蛋白含量最大，分别达到84.6 g/L，13.7 g/L。

1.4 pH控制

为了实现胶原蛋白的批量化生产，王维卓^[29]等进行了重组类人胶原蛋白II发酵过程中关键参数pH的深入研究。研究发现恒定pH（6.8或7.5）发酵，最大细胞浓度为68.5 g/L，类人胶原蛋白II的最大产量为10.5 g/L，通过调整pH控制策略，诱导前控制pH为7.5，诱导后控制pH为6.8，最终细胞浓度未见明显提高，但目的蛋白浓度可达到11.3 g/L，较恒定pH6.8或7.5条件下提高了7.61％。

1.5 碳氮比

为了提高类人胶原蛋白表达产量，Guo^[30]等研究了碳氮摩尔比对细胞密度和蛋白产量的影响，在发酵过程中设置分批培养基和补料培养基中的三种碳氮摩尔比分别设置为2.36:1和5.12:1，获得了最高的干细胞密度（67.2 g/L干细胞重）和最高的类人胶原蛋白产量（10.8 g/L）。张发勇^[31] 等研究了不同碳氮浓度对重组胶原蛋白的影响。是在实验中将甘油、酵母粉、蛋白胨作为碳氮源，通过添加不同重量控制碳氮质量比值在0.76~35.45，通过5 L发酵罐进行验证，检测发酵液中的重组胶原蛋白含量和菌体数量，发现当碳源：氮源=1:1.54时，重组胶原蛋白的表达量最高，占比大约为15%。

2 纯化篇

要研究胶原蛋白，首先要得到高纯度的、具有生物学活性的、相对稳定的目标蛋白，然后才能对性质进行研究，进而才可能对其进行大规模生产应用，造福于人类。而胶原蛋白在组织或细胞中一般都是和其他蛋白、细胞器、遗传信息以混合物的形式存在，不同类型的细胞中存在的蛋白质在结构和功能等方面也不相同，这使得重组胶原蛋白的分离和纯化变成了一项精细而复杂的任务^[32]。因此，高效的蛋白纯化技术和手段是胶原蛋白研究的基础和关键之一。

目前，蛋白质下游分离纯化工艺的主要理论基础是根据蛋白质的理化性质，如溶解度、密度、电离性质、亲水性、配位吸附特异性、分子大小及形状和生物学功能等。目前，常用于分离和纯化胶原蛋白的几种主要技术有等电点沉淀法^[33]、盐析法^[34]、超滤法^[35]、亲和层析^[36]、凝胶过滤层析和离子层析^[37]，冷冻干燥^[38]等。下游纯化过程经典模式是三步纯化策略:捕获、中间纯化和精纯化^[39]。这个模式并不意味着纯化过程只包含三步层析或分离。相反，它指的是纯化的一般方法。实际应用中，中间纯化和精纯化紧密相关，它们可以将微量残留去除，如内毒素等致敏物质，这些残留在产品捕获阶段不能够从粗原料中去除。依据捕获后产品的相应纯度，可能仅仅需要一步精纯化就能达到所需要的纯度。事实上，许多开发的技术是两部纯化平台，通常是亲和捕获和离子交换精纯化。不管在纯化过程中含多少分离技术，今天大多数使用的分离技术通常包含其中，选择何种纯化方法主要依据产品和污染物的相互关系。介绍几种常用的纯化工艺和在胶原蛋白制备过程中的应用。

2.1 超滤

超滤过程属于对混合物料的筛分过程，驱动力来自于超滤膜两侧的压力差，过滤介质是超滤膜，料液在物料泵的带动下会提供一定的压力，当料液流过膜表面时，由纤维素或聚醚砜材质组成的固定孔径的超滤膜只允许水及小于超滤膜孔径大小的小分子物质通过而成为透过液，而料液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，在重组胶原蛋白的纯化过程中，超滤可以对料液进行净化、分离和浓缩^[40]。超滤装置一般由若干超滤组件构成，超滤膜，水泵，管道等，膜是超滤的关键器材。胶原蛋白的纯化过程中根据不用的用途采用不同类型的膜，常用的类型比如：采用中空纤维膜进行料液的澄清甚至是发酵液的除菌，采用平板膜进行胶原蛋白料液的浓缩和脱盐，具有操作简单、成本低、损失小、可以较好的保持生物活性等优势^[41]。

表2 超滤膜分离技术用于胶原蛋白纯化的应用举例

Tab.2 An example of application of ultrafiltration membrane separation technology to collagen purification

膜材料	截留分子量/Da	操作压力	应用	参考文献
再生纤维素	10 kD	2.0 bar	脱盐	[42]
聚醚砜	10 kD	2-6 bar	蛋白渗透	[43]
再生纤维素	5 kD	5 bar	浓缩	[44]
再生纤维素	5 kD	5 bar	浓缩	[45]
_	30 kD	_	脱盐，除杂	[24]

2.2 层析

层析是生物技术行业蛋白质纯化的主要方式。主要包括两种模式：第一种是层析柱与目标蛋白结合，杂质流穿，进入废液，再进一步洗脱收集目标蛋白；另一种是层析柱与杂质结合，目标蛋白流穿收集^[3]。加入组氨酸（His）标签构建的大肠杆菌表达重组胶原蛋白纯化过程中常采用第一种纯化模式，大大提高了蛋白提取纯化过程效率和收率。

重组胶原蛋白纯化常采用的层析方式主要包括：亲和层析，离子层析，凝胶过滤层析。

亲和色谱（Affinity Chromatography），也称亲和层析，是目前分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术^[46]，在其分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在重组胶原蛋白的分离中具有重要的技术支持。例如我们所熟知的酶与底物或抑制剂、抗原与抗体、激素与受体等，利用这种性质可以实现对生物分子进行分离纯化。

张卉^[47]将破碎后的大肠杆菌发酵重组类人源蛋白滤液上Ni柱亲和柱，洗杂缓冲液是含200 mM咪唑（pH 6.0）用于清洗未与亲和填料结合的杂蛋白，亲脱缓冲液是含有500 mM咪唑（pH 6.0）用于洗脱目的蛋白，收集各洗脱峰，跑蛋白胶分析收集的洗脱峰哪个是目标蛋白对应的峰。此方法获得的目的蛋白纯度大于93.5%。

离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC），也称离子亲和层析，是利用离子填料的可交换离子与处理料液中蛋白所带的电荷作用力不同，遵循同种电荷排斥，异种电荷进行结合的规律，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法^[48]。除了亲和层析，在重组蛋白的纯化中最常用到的层析方式是离子交换层析。使用离子交换层析介质作为重组蛋白的初始捕获阶段具有一些优势，它通常比亲和介质具有更高的载量而且清洗更简单。除此之外，根据工艺不同选择对应的填料，离子层析技术在清除内毒素方面具有较好的效果^[49]。梁鑫^[50]等将重组人III型胶原蛋白发酵液盐析获得的胶原蛋白，上SP Sepharose HP 阳离子交换柱进行纯化，最终获得的重组胶原蛋白纯度97.7%，总回收率68.8%，并且内毒素含量低，可用作医药原料。

凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是利用具有多孔网状结构的颗粒的分子筛作用，根据被分离样品中各组分相对分子质量大小的差异进行洗脱分离的一项技术，也叫分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）^[51]。

刘斌^[52] 为了得到重组人源胶原蛋白，对三种纯化方式进行了对比，分别是①盐析；②盐析+离子层析+凝胶过滤层析；③凝胶过滤层析。结果表明：采用方式②得到的重组胶原蛋白纯度99.6%，回收率77.3%；采用方式③得到的重组胶原蛋白纯度95.5%，回收率93.6%。方式③纯化处理过程简单，更适合工业化操作。

2.3 磁性吸附

磁性吸附，又称磁珠，也是一种常用的蛋白纯化方式，采用与传统的亲和层析相同的吸附原理和配基，填料的形式和采用方式存在一定差异，也免去了层析系统高成本的因素。原理：利用共价偶联于磁珠上的配基—亚氨基二乙酸(IDA)与金属离子(Ni ²⁺，Co ²⁺，Cu²⁺等)发生螯合作用，该金属离子又可与蛋白分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸特异性结合，不与杂质蛋白或其它杂质结合，实现标签蛋白与杂质的分离。

CN 111087464 B^[54]专利中使用磁珠纯化裂解的大肠杆菌发酵重组胶原蛋白滤液，最终得到的重组人源III型胶原蛋白具有三螺旋结构，并证明该蛋白具有更好的稳定性和功能性，更能媲美天然人源III型胶原蛋白生物活性。

3 研究展望

目前，重组胶原蛋白因有良好的水溶性、低免疫排斥性、高稳定性和易吸收的特点在化妆品、食品和医疗器械等领域使用越来越广泛。从行业了解的信息发现，重组胶原蛋白的制备尤其是生产工艺也面临着一些问题和困惑。因此，本文对重组胶原蛋白的生产工艺优化有几点展望：①现阶段重组胶原蛋白的表达体系主要以大肠杆菌和毕赤酵母为主，其中大肠杆菌细胞中不含脯氨酸羟化酶，利用合成生物学技术，可以在大肠杆菌中导入羟化酶基因，使其一步法获得羟化的重组胶原蛋白^[55]。②针对重组胶原蛋白发酵产量低的问题，一方面基于CRISPR-Cas、pG:ISSI等多种基因编辑工具，结合蛋白质工程、合成生物学及微生物生理工程等技术手段，在底盘细胞中快速实现代谢通路的构建和优化，形成工程菌株库，以此极大提高获取目标生产菌株或菌群的成功率，从而提升“细胞工厂”的合成效率^[56]。另一方面，优化发酵参数，如：溶氧，pH，碳氮源，温度和诱导剂量等条件，提高发酵产量。③重组胶原蛋白纯化工艺成本特别高，如注射级重组胶原蛋白的制备过程必须使用价格昂贵的亲和填料大大增加了生产成本，未来研究中，加大纯化工艺的优化研究，使用操作简单，成本低的工艺代替亲和、离子等工艺。在重组胶原蛋白上下游工艺研究上持续注入研发资金和精力，共同推动着重组胶原蛋白市场的良好发展，相信中国的胶原蛋白企业将向全球展示前沿的制备技术和物美价廉的重组胶原蛋白原料。

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