基于液相色谱-三重四级杆质谱联用测定烟用接装纸中纽甜的含量
姚彬彬，王坤，崔同旭，郑轩，张东海，于宏晓
山东中烟工业有限责任公司技术中心，山东 济南 250000
摘要：建立并优化了液相色谱-三重四级杆质谱联用（LC-TQ）测定烟用接装纸中纽甜含量的方法。样品前处理方式为采用90%异丙醇-10%三乙胺缓冲液进行超声萃取30min。梯度洗脱的流动相组成为甲醇和5mmol/L乙酸铵的水溶液。质谱检测使用安捷伦喷射流离子源，监测模式为正离子多反应监测，根据保留时间定性，定量方法为峰面积外标法。结果显示，选择较优条件时，纽甜在0.1μg/mL~10μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系（R2＞0.995），检出限为0.004μg/mL，定量限为0.014μg/mL，加标回收率在86.81%~100.51%之间，相对标准偏差在0.68%~2.19%之间。
关键词：液相色谱-三重四级杆质谱联用；烟用接装纸；纽甜；定量
中图分类号：TS411 文献标志码：A
Determination of Neotame Content in Tipping Paper based on Liquid Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry
Yao Binbin，Wang Kun，Cui Tongxu，Zheng Xuan，Zhang Donghai，Yu Hongxiao
Technology Center of China Tobacco Shandong Industrial Co.,Ltd.，Jinan 250000，China
Abstract:A method for determining the content of neotame in tipping paper using liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry (LC-TQ) was established and optimized .The samples pretreatment method involved ultrasonic extraction for 30 minutes using a 90% isopropanol-10% triethylamine buffer solution.The mobile phase for gradient elution was methanol and aqueous solution of 5 mmol/L ammonium acetate.The mass spectrometry detection utilized an Agilent jet stream ion source,with a monitoring mode of positive ion multiple reaction monitoring.The qualitative analysis was based on the retention time, the quantitative method was the external standard method based on peak area.The results showed that under optimimal conditions, neotame exhibited a good linear relationship(R2＞0.995) within the concentration range of 0.1 μg/mL to 10 μg/mL, with a detection limit of 0.004 μg/mL and a quantification limit of 0.014 μg/mL. The recovery rate of spiked samples was between 86.81% and 100.51%, and the relative standard deviation was between 0.68% and 2.19%.
Keywords:Liquid Chromatography Triple Quadrupole Mass Spectrometry；Tipping Paper；Neotame；Quantify
0 引言
近年来，为了改善卷烟抽吸的感官品质，各烟草工业企业先后采用烟叶加料、烟丝加香、接装纸打孔、特种功能滤棒等一系列技术，取得了显著的效果。其中，江苏中烟在2009年开创性地在接装纸中施加甜味剂，直接改善了卷烟的口感和风味，得到了消费者的广泛认可。随后，福建、湖北、河南、河北、广西、山东等多家中烟公司相继推出了甜味接装纸的卷烟产品，在嗅觉和味觉上带给消费者不一样的感官体验[1-3]。
纽甜是一种常用的非营养性人工合成甜味剂，可用于食品中增加甜度、改善风味，也是卷烟接装纸常用的甜味剂之一[4]。然而，接装纸添加甜味剂的部分卷烟产品存在甜度不均匀、甜味剂含量波动较大等问题，直接影响了卷烟产品质量稳定。目前，对于甜味剂的常用分析方法分别有液相色谱法[5-9]、离子色谱法[10-12]、气相色谱法、分光光度法以及薄层色谱法、电化学方法、毛细管电泳法等[13-21]。然而液相色谱法、离子色谱法及毛细管电泳法等灵敏度较低，而液相色谱-串联质谱技术因拥有高效准确以及灵敏度高等优点，在食品安全检测和代谢组学分析等领域具有广泛的应用。烟用甜味接装纸中所含甜味剂一般含量不高，为准确、客观评价接装纸中甜味剂的施加量和稳定性，以便于进一步稳定卷烟产品的内在质量、彰显卷烟产品的风格特征，本工作通过实验进一步细化样品的前处理条件，建立并优化了LC-TQ测定烟用接装纸中纽甜含量的方法[22]。该方法操作简单，分析时间短且具有较高灵敏度，为测定烟用接装纸中纽甜的含量提供了一种可行的方法。
1 实验部分
1.1材料、试剂和仪器
含有纽甜的烟用接装纸（青岛嘉泽包装有限公司提供）；甲醇（HPLC级，德国Merck KGaA公司）；异丙醇（HPLC级，美国RiMedCo公司）；乙酸铵（分析纯，国药试剂）；甲酸（HPLC级，迪马科技有限公司）；三乙胺（优级纯，天津欧博凯化工有限公司），纽甜（CAS：165450-17-9，含量≥98.0%，国药试剂）。
液相色谱-串联质谱（型号：1290 Infinity Ⅱ/6470B，美国Agilent公司）；WS-150D型振荡器（维根技术（北京）有限公司）；Sigma离心机3K15（德国希格玛实验室离心机公司）；KQ-500VDV台式三频数控超声波清洗器（超声电功率500W，标准超声频率：45/80/100KHz，昆山市超声仪器有限公司，舒美牌）；电子微量分析天平（型号：ML304T，精度：0.1mg，瑞士梅特勒托利多公司）；超纯水系统（型号：Milli-Q Advantage A10，美国Millipore公司）；有机相滤膜，0.22μm。
1.2 方法
1.2.1 系列标准工作溶液制备
制备浓度为100μg/mL的标准储备液：使用校准合格的电子天平准确称取10mg纽甜（精确至0.1mg），转移至100mL棕色容量瓶中，用超纯水溶解、定容并摇匀。再用移液枪分别准确移取10μL、50μL、200μL、500μL和1000μL上述标准储备液至10mL棕色容量瓶中，最后加入超纯水至刻度线，获得5级纽甜系列标准工作溶液，各级系列溶液浓度见表1.1所示[23]。
表1.1 纽甜系列标准工作溶液
Table 1.1 Neotame series standard working solutions
纽甜系列标准工作溶液 | 1# | 2# | 3# | 4# | 5# |
浓度/（μg/mL） | 0.1 | 0.5 | 2.0 | 5.0 | 10 |
1.2.2 样品前处理
根据纽甜的化学性质可知，纽甜最稳定的pH值是4.5[4]。因此，取0.8mL甲酸滴加到1000mL水中，搅拌均匀，再逐滴加入2.5mL三乙胺，调节pH值等于4.5，配制成三乙胺缓冲液。按照YC 171-2014规定的方法抽取烟用接装纸样品，量取并截剪面积为7.62cm×2cm试样，用电子天平称其质量（精确至0.1mg），然后沿着较长的一边将涂抹光油的一面向内对折后剪碎成纸条，面积约为1cm×2cm，全部装至50mL具塞锥形瓶中，用移液枪向其中加入20mL三乙胺缓冲液并浸没所有纸条，然后超声萃取（超声频率设定为45KHz，功率调整为80%，时间设置为40min，为防止水浴温度超过40℃，必要时加冰袋）[22]。萃取结束后摇匀，取适量萃取液至离心管中并在转速为5000r/min的离心机上离心10min，静置片刻，取上层清液过0.22μm有机相滤膜后得到滤液，待上机分析。
1.2.3 仪器工作条件
1）色谱参数：使用Waters Symmetry®C18色谱柱（规格：150mm×4.6mm，填料粒径5μm）；样品进样量设置为5μL；柱温维持在40℃；流动相流速设定为0.4mL/min；流动相由甲醇（A相）和5mmol/L乙酸铵水溶液（B相）组成；梯度洗脱程序如下：0~2min，A相比例从70%增至80%，B相比例从30%减至20%，2~10min保持80%A和20%B的比例，10~10.1min恢复至70%A和30%B的比例。
2）质谱分析参数[21]：采用电喷雾电离源作为离子源（AJS-ESI）；干燥气体温度设定为300℃；离子源温度设定为100℃；喷雾气体压力调整至40Psi；干燥气体流量调整为9L/min；毛细管电压设定为正离子模式，电压设置为4000V；检测模式选择多反应监测（MRM），具体参数列至表1.2中。
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化
在电喷雾电离源（AJS-ESI）的正离子模式中，对最高浓度的纽甜标准溶液实施全面的质谱扫描，以获得纽甜的一级质谱图。对比纽甜所有特征离子的丰度，从中筛选出丰度最高的离子作为纽甜的母离子，然后采用选择离子扫描模式对纽甜标准溶液再次进行扫描，同时对不同的裂解电压进行优化。将母离子丰度最高时的电压确定为最佳的裂解电压，在最佳的裂解电压下进行二级质谱扫描来确定纽甜的子离子，并选择其中两组特征离子分别作为纽甜的定量和定性子离子，用于纽甜的定量和定性分析[22]。最终，通过优化碰撞能量，得到纽甜的优化质谱参数，如表1.2所示。
表1.2 纽甜的MRM参数
Table 1.2 MRM parameters of Neotame
甜味剂名称 | 保留时间/min | 离子源 模式 | 母离子（m/z） | 裂解电压 /V | 子离子*（m/z） | 碰撞能量* /（eV） |
纽甜 | 6.210 | + | 379 | 135 | 172.1，319.3 | 25，20 |
*：前面的为定量子离子和碰撞能量，后面的为定性子离子和碰撞能量。
2.2 色谱条件的优选
通常情况下，在反相色谱的流动相组成中，水相为纯水，有机相为甲醇、乙腈等常用有机溶剂，由于待测组分唯一且乙腈比甲醇的毒性大，所以将甲醇作为本实验的有机相。由于流动相经液相后进入质谱检测器，一般在流动相中加入一定量的缓冲盐溶液，待测物质的响应值会有所提高，所以考虑比较3种流动相体系的响应情况，分别为甲醇-水溶液、甲醇-甲酸的水溶液和甲醇-乙酸铵的水溶液 [22]。在参考相关文献的基础上，最终选择用甲醇-5mmol/L乙酸铵的水溶液为流动相组成进行梯度洗脱。
2.3 萃取剂的确定
纽甜属于二肽类化合物，在水中和醇中有较好的溶解性，分别选择三乙胺缓冲液、甲醇、异丙醇为萃取剂，萃取结果如图1.1所示。
图1.1 不同萃取剂时纽甜含量的检测结果
Figure 1.1 Detection results of neotame content with different extractants
从图1.1可以看出，使用醇类作为纽甜萃取剂的效果明显好于三乙胺缓冲液。为探究上述现象出现的原因，分别从纽甜的溶解性和接装纸制造工艺两方面进行了分析。首先，纽甜的化学名称是N-[N-(3,3-二甲基丁基)-L-α-天冬氨酰]-L-苯丙氨酸-1-甲酯，在非水溶剂中通常具有更高的溶解度；其次，在纽甜被施加到接装纸的工艺过程中，会首先与光油体系进行混合，再涂布于纸张上面，进而导致了施加的纽甜可能有一部分被光油覆盖住，从而不易完全被水萃取出来。此外，采用异丙醇萃取时纽甜含量检测结果略高于采用甲醇萃取。
2.4 萃取相比例的优化
为进一步优化萃取相，根据上述结果，分别使用不同体积分数的甲醇-三乙胺缓冲溶液和异丙醇-三乙胺缓冲溶液为萃取溶剂，检测结果和萃取后溶液状态分别如图1.2和表1.3所示。
图1.2不同比例有机相溶液萃取时纽甜含量的检测结果
Figure 1.2 Detection results of neotame content in organic phase solutions with different ratios during extraction
从图1.2可以看出，随着萃取溶液中有机相体积比例的提高，纽甜被检出含量逐渐增加，并且从整体上看，使用异丙醇-三乙胺缓冲液的萃取效果好于甲醇-三乙胺缓冲溶液，采用100%异丙醇作为萃取剂时能够检测到最大的纽甜含量。从表1.3可以看出，接装纸在异丙醇/三乙胺缓冲液的混合溶剂中容易褪色，这可能促使混合在光油里被覆盖的纽甜被充分溶出。然而，当使用100%异丙醇进行萃取时，发现质谱峰型出现扭曲现象而不便于积分计算。为此，在兼顾萃取效果和准确积分峰面积的基础上，优选萃取溶剂为90%异丙醇-10%三乙胺缓冲溶液。
表1.3 萃取相溶剂组成对萃取后溶液状态的影响
Table 1.3 Effects of solvent composition in the extraction phase on the state of the extracted solution
萃取相溶剂组成 | 萃取后溶液状态 |
100%甲醇 | 溶液澄清，接装纸不褪色，无絮状物 |
100%异丙醇 | 溶液澄清，接装纸不褪色，无絮状物 |
90%甲醇+10%三乙胺缓冲液 | 溶液澄清，接装纸不褪色，有少量絮状物 |
90%异丙醇+10%三乙胺缓冲液 | 溶液浑浊，接装纸褪色 |
80%甲醇+20%三乙胺缓冲液 | 溶液澄清，接装纸不褪色，有较多絮状物 |
80%异丙醇+20%三乙胺缓冲液 | 溶液浑浊，接装纸褪色 |
70%甲醇+30%三乙胺缓冲液 | 溶液澄清，接装纸不褪色，有大量絮状物 |
70%异丙醇+30%三乙胺缓冲液 | 溶液浑浊，接装纸褪色 |
2.5 萃取方式和时间的选择
为优化样品的萃取方式及适宜时间，以90%异丙醇-10%三乙胺缓冲溶液为萃取液，萃取方式分别为超声波萃取、摇床振荡萃取，考察两种方式下接装纸中纽甜萃取量随萃取时间的变化情况，结果如图1.3所示。可以看出，两种萃取方式下纽甜的浓度与萃取时间有明显关系，即纽甜浓度随时间延长都呈现先升高后下降的趋势。在设计的时间间隔条件下，超声萃取在30min时达到最大值，振荡萃取在40min时达到最大值；整体来看，超声萃取结果大于振荡萃取结果，这可能是超声萃取时的高频振荡加速了光油和纽甜的溶出扩散。关于这一点，可以对比超声萃取和振荡萃取条件下样品的实际呈现状态，如图1.4所示。超声萃取条件下，接装纸褪色严重，萃取液浑浊；振荡萃取条件下，接装纸无明显变化，萃取液澄清。因此，综合考虑萃取结果和前处理效率，最终选择超声萃取的方式，萃取时间为30min。
图1.3 不同萃取方式和时间对纽甜检测结果的影响
Figure 1.3 Effects of different extraction methods and times on the detection results of neotame
图1.4 超声萃取和振荡萃取后样品实际状态
Figure 1.4 Actual state of samples after ultrasonic extraction and oscillatory extraction
2.6方法学验证
2.6.1 考察本方法的线性范围、检出限和定量限
利用已经优化的液相色谱-三重四极杆质谱（, LC-TQ）参数，对纽甜从低浓度到高浓度的五级系列标准溶液进行检测，将纽甜的峰面积及其对应的质量浓度拟合成标准曲线，并展开线性回归分析，获得线性方程。选取纽甜的最低浓度标准样品，进行9次连续进样以获得平行测试结果，并据此计算结果的标准偏差。将该标准偏差依次扩大3倍和10倍后的对应值分别作为本方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）[24]。如表1.4所示，纽甜在本方法所考察的浓度范围内显示出较好的线性关系，相关系数（R2）超过0.995，检出限为0.004μg/mL，定量限为0.014μg/mL，适用于烟用接装纸中纽甜的定量分析[25]。
表1.4 纽甜的回归方程、浓度范围、相关系数、检出限和定量限
Table 1.4 The regression equation, concentration range, correlation coefficient, detection limit, and quantification limit of neotame
甜味剂名称 | 回归方程 | 浓度范围 /（μg/mL） | 相关系数 | LOD/（μg/mL） | LOQ /（μg/mL） |
纽甜 | y=1084205.09x+211848.70 | 0.10~10 | 0.996 | 0.004 | 0.014 |
2.6.2 考察本方法的准确度和精密度
以烟用接装纸样品为测试对象，方法的准确度是通过测定加标样品的回收率来验证，方法的精密度则是利用相对标准偏差（RSD）来评估[24]。分别在低、中、高三个不同的加标浓度水平上各进行六次重复实验，以六次重复实验的检测结果分别计算接装纸样品溶液中纽甜在低、中、高三个浓度下回收率和RSD，测试结果如表1.5所示。可以看出，纽甜在三个不同浓度水平下都展现出良好的回收率和RSD，其中加标回收率范围为86.81%~100.51%，RSD范围为0.68%~2.19%，这表明该方法在测定烟用接装纸中的纽甜含量方面具有较高的准确性和重复性，可以满足对微量成分的定量分析要求。
表1.5 三种不同浓度下纽甜的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 1.5 The spiked recovery rates and relative standard deviation of neotame at three different concentrations (n=6)
甜味剂名称 | 低浓度 | 中浓度 | 高浓度 | |||
回收率/% | RSD /% | 回收率/% | RSD /% | 回收率/% | RSD /% | |
纽甜 | 100.51 | 2.19 | 94.10 | 1.41 | 86.81 | 0.68 |
3 结论
本实验主要通过对烟用接装纸样品前处理条件进行优化，建立了液相色谱-串联质谱（LC-TQ）外标法测定烟用接装纸中纽甜含量的方法。结果表明，采用90%异丙醇-10%三乙胺缓冲液为萃取液，同时以超声方式辅助萃取30分钟为合适的前处理方法。相关参数优化后，纽甜在实验所考察的浓度范围内显示出良好的线性关系（R2大于0.995），LOD和LOQ分别为0.004μg/mL和0.014μg/mL，加标回收率在86.81%~100.51%之间，RSD在0.68%~2.19%之间。本方法具有快捷、高效、灵敏度高等特点，可用于烟用接装纸中纽甜含量的定量检测。
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