胶体金免疫层析技术应用于食品检测的研究进展
刘超1，杨静1，伍春媛，彭开美*
（黔南民族师范学院 化学化工学院，贵州 都匀 558000）
摘要：随着国民经济的发展和生活质量水平的提高，食品安全问题得到了社会及公众的广泛关注。食品质量的检测技术可分为化学比色法、酶联免疫吸附测定法以及胶体金免疫层析试纸条技术。胶体金免疫层析试纸条技术具有响应迅速、灵敏度高、精确、成本低、操作便捷和具有特异性等特点，是一种固相标记检测技术，目前在食品安全检测领域逐步流行。本文概述了胶体金免疫层析技术的原理及其在食品检测方面的应用，以期为相关的应用与开发提供技术参考。
关键词：胶体金；食品检测；免疫层析试纸；快速检测
Research progress on the application of colloidal gold immunochromatographic technology in food testing
Liu Chao1, Yang Jing1, Wu Chunyuan, Peng Kaimei*
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Qiannan Normal University for Nationalities, Duyun 558000, China)
Abstract: With the development of the national economy and the improvement of the quality of life, food safety has received extensive attention from the society and the public. The detection technology of food quality can be divided into chemical colorimetric method, enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold immunochromatographic test strip technology. Colloidal gold immunochromatographic test strip technology has the characteristics of rapid response, high sensitivity, accuracy, low cost, convenient operation and specificity, which is a solid phase labeling detection technology, which is gradually popular in the field of food safety testing. This article summarizes the principles of colloidal gold immunochromatography and its application in food testing, in order to provide technical reference for related applications and developments.
Keywords: Colloidal gold; Food testing; Immunochromatographic test strips; Rapid detection
基金项目：贵州省黔南州“揭榜挂帅”教科研项目（2024B003）。
作者简介：刘超，硕士，讲师，研究方向为有机高分子合成及材料改性。
杨静，硕士，讲师，研究方向为痕量物质检测及成分分析。
通信联系人：彭开美，博士，副教授，研究方向为检测及传感分析。
据近5年我国的食品安全检测抽查显示，在食品安全问题中，食品添加剂的过量使用、微生物污染以及农用动物用药问题尤为突出，据统计，该三类问题在不合格食品样品问题检查中出现的概率高达75.4%[1]，严重影响了公众健康安全以及生活质量水平的提升，因此，消费者导向的食品行业必须引入全面系统的食品质量检测分析方法。在食品安全性快速检测领域中，有多种技术手段被广泛采用。其中，化学比色法、酶联免疫吸附测定法、电化学分析法以及免疫层析技术(Gold immunochromatography assay , GICA)[2]是主要的检测分析技术，但不同的检测分析方法各有特点，需要进一步确定其使用场景及局限性。免疫层析技术不仅具有简便快速、高灵敏度和高特异性的显著特点，而且在成本、设备需求、时间效率、安全性能、人员配备以及测试成本等方面均呈现出了更为明显的优势。GICA特别适用于食品生产者和监管人员在日常工作中的筛查工作，既能节省筛查时间及成本，又能保证筛查质量。鉴于GICA具备的这些显著特性，因此该分析技术在食品安全、环境监测以及医疗诊断等多个领域均得到了广泛而深入的应用[3]。本文概述了胶体金免疫层析技术的原理及其在食品检测方面的应用，探讨我国免疫层析相关方法标准的制定与实施情况展望其在未来发展中的可能方向，以期为相关的应用与开发提供技术参考。
竞争法在小分子物质的检测中发挥着重要作用[4]，是一种常用的检测方法。其工作原理在于利用胶体金标记抗体的竞争效应来进行检验。该方法采用少量抗体与胶体金结合，并在检测线上固定抗原，从而实现了对待测物质的灵敏检测。在样品中若存在待检测的抗原，它会优先与胶体金标记的抗体发生结合反应。夹心法，也被称为双抗体夹心法[5]，其机制在于利用胶体金标记抗体和检测线抗体的特异性。在样品中，若存在待检测的物质，该物质会优先与胶体金标记的抗体发生结合反应。紧接着，在试纸条的毛细效应作用下，这些复合物将迁移至检测线区域，并与检测线上的抗体发生特异性结合。由此，便形成了由胶体金标记抗体、检测物质以及检测线抗体组成的双抗体夹心结构。该检测法要求待测物质在两个不同位点与抗体结合，因此，它主要适用于大分子物质，如细菌和病毒的检测。
间接法是一种重要的检测方法[6]，其基本原理在于利用胶体金偶联物作为抗抗体。该方法利用特异性抗原在检测线位置进行反应，实现对IgG和IgM类型抗体的有效检测。首先，抗体会与胶体金标记的抗抗体发生结合，随后在试纸条的毛细效应作用下，这些复合物会移动至标线处，与具有特异性的抗原形成新的复合物，新复合物具有抗原、待检测物质以及胶体金偶联抗抗体共同构成的结构。最终，胶体金颗粒通过间接作用在检测线处聚集并显色，从而实现对动物体内该病原特异性抗体的检测，进而间接达到检测病原的目的。此方法主要用于血清中抗体的检测工作。
胶体金免疫层析试纸条支持半定量及定量两种检测方式。在半定量检测中，我们采用多道检测线的方式，其原理基于定性检测。通过在NC膜上涂布多道具有不同递增或递减浓度的捕获试剂，我们能够对样品浓度进行半定量评估[6]。
目前，便携式带式光谱仪在数量观测方面已经得到了广泛运用。在观测过程中，我们主要关注检测线上红色条带的出现及稳定情况。当红色条带稳定显现后，我们利用便携式光谱仪对其吸光度数据进行检测并详细记录。进一步地，结合检测物的标准浓度和测量线上红带强度的校准曲线，我们可以精确地计算出检测物质的浓度值。此外，用于数量检测时也有采用耦合传感信号器件的方式，例如：光学、电学和磁学传感器，但是这种方式耗费较高的成本[7]。
具体而言，胶体金免疫层析技术具备以下多个显著优势。
（1）卓越的安全性。与传统的荧光素、酶标记及放射性同位素等检测技术相比，该技术在检测过程中使用的试剂更为安全无害，不仅不会对研究人员构成潜在威胁。
（2）检测灵敏度与预期高度一致。该技术依赖于单克隆抗体的标记机制，只有抗原决定簇能与之表现出亲和性和特异性，这也是其实现出色灵敏度的核心所在。
（3）极佳的化学稳定特性。从物理学角度解析，胶体金对蛋白质的标记过程本质上属于蛋白质吸附作用。这一过程通常不会对蛋白质的活性造成消极影响[8]。
2 胶体金免疫层析技术在食品领域的应用
2.1 食品农药、兽药残留的检测
在现今市场上，食品种类琳琅满目，但不乏存在着农药和兽药残留的情况，随着食物链的循环，这些具有毒危害的物质终会对人体造成危害。胶体金免疫层析法具有灵敏度高、操作便捷和具有特异性等特点，在食品安全检测中备受欢迎。赵正苗等人[9]通过氟喹诺酮类胶体金免疫试纸条，对奶制品中残留的氟喹诺酮类药物进行了检测，响应时间仅需5分钟，和奶制品中其他残留的有害物不发生交叉反应，检测结果准确。
磺胺基胶体药物能够治疗动物全身性感染，但这类药物使用后在动物体内会有残留，影响食品质量，张佳宜等人[10]用柠檬酸三钠作为原料，采用还原法成功合成了胶体金，并对免疫层析法进行了优化探索。研究结果表明，采用该方法能够成功检测到牛肉和奶制品中的磺胺残留量，并确定磺胺嘧啶的标准值为20g/kg。同时，该方法所得结果与高效液相色谱法（HPLC）的检测结果相吻合，从而验证了该检测方法的准确性，且该方法的检测时间仅需10分钟。阿特拉津作为一种瓜果、茶园及农作物常用的除草剂，具有除草效果好、持久性强等优点，但使用量大且残留时间长，对人体具有潜在的致癌风险。那宇等人[11]运用胶体金免疫层析法，对饮用水和高粱中残留的阿特拉津进行了检测。结果显示，该方法与间接酶联免疫吸附法（ELISA）的检测结果相吻合。在该项研究中，胶体金免疫层析法的最低检测极限达到了2 ng/mL，完全符合阿特拉津残留量检测的要求。随着免疫层析技术的持续进步，万与平[12]等人成功地研制了一种胶体金免疫层析试纸条，该试纸条能够检测蔬菜、水果、饲料和牛奶中的滴滴涕半抗原，其检测下限为5μg，检测周期为15分钟，假阳性率和假阴性率都为零。
2.2 非食品添加成分的检测
罗丹明B（RB）是人工合成的一种具有强碱性荧光物质，呈亮桃红色，在室温下呈暗红色或红褐色结晶状，是一种偶氮染料，具有致癌、致突变性，卫生部早在2004年将其列入了食物的禁止成分。尽管如此，由于其优异的着色能力和鲜艳的色泽，RB仍然被用作非食品添加剂，添加到花椒、辣椒中[13]。对食品中 RB的检测主要有HPLC、液质联用（LC-MS）和荧光探针等，这些方法在分离效果和灵敏度方面表现出色。然而，由于设备成本高昂且前期处理过程繁琐，这些方法并不适用于现场快速检测和筛选工作。相比之下，免疫层析试纸检测技术特别适用于大规模产品的筛检和检测工作。
郑佳妍[14]团队致力于深入探索免疫层析技术在RB快速检测试纸技术中的应用，为RB的快速筛查与检测提供了坚实的技术支撑。郑佳妍等人利用R123成功制备了完整的抗原与多克隆抗体，他们选择甲醇作为提取剂，直接从辣椒粉和花椒中提取RB。经过10倍稀释后，成功将背景干扰降至最低。团队成员在实验中进一步确定了抗原的包被量为3.75μg，同时鉴定了免疫金的稀释度为1：2。在经过一定优化实验条件后，将金标记抗体与RB标准品溶液或样品提取液按1：5的体积比混合，可呈现出效果最佳的胶体金试纸检测效果。该方法能够在10至15分钟内迅速得出结果，无需依赖特殊设备，因此特别适合用于大批量产品的现场快速检测工作。该方法属于定性半定量范畴，其检出限可达到0.5 ng/mL，具备足够的灵敏度以满足对调味料中RB的检测需求。
三聚氰胺（melamine，MA），别名蛋白精，是一种氮杂环有机化合物，人体长期摄入该物质，会对生殖系统和泌尿系统造成严重损害，甚至可能诱发膀胱癌。目前，用于鉴定奶粉或奶制品中三聚氰胺含量的主流技术主要有ELISA、HPLC、GC-MS以及LC-MS等多种方法，与以上的检测技术相比，GICA在速度、简洁性、经济性和安全性方面都展现出了明显的优越性。基于GICA的理念，潘声旺[15]团队成功开发了一种用于乳制品中MA的快速检测技术和相关产品，这为乳制品质量的快速检测提供了重要的技术支撑。潘声旺团队对市场上常见的多种乳制品，涵盖了灭菌纯牛奶、调制复原奶、巴氏杀菌乳、原味纯酸奶和果粒酸牛奶进行了深入的研究。为了验证GICA试纸对不同批次产品的检出能力，研究人员分别向试纸中添加了不同质量分数的MA标样，包括40、80和160μg/kg，并进行了多次重复实验，得出灭菌纯牛奶、巴氏杀菌乳对GICA试纸最敏感，LOD=40μg/kg。以低温调制过的奶和未经调制的原味酸奶为例，它们的检测限（LOD）值为80μg/kg；而果粒酸牛奶对GICA试纸的敏感度较低，LOD值为160μg/kg。
2.3 食品霉菌毒素的检测
霉菌生成的有毒代谢产物，即霉菌毒素，具有极强的毒性，污染范围广泛，它可与食品中的有机化合物结合，对生物体构成严重威胁。为了实现对牛奶等食品样本中的白喉毒素进行精确检测，LYUBAVINAL等[16]研发了一种基于胶体金标记单克隆抗体的免疫层析分析方法，该方法的毒素检测限为10 ng/mL，操作简便快捷，仅需15分钟即可获得结果。若通过银显影液对单克隆抗体进行影选，其最低检测浓度可可达到1.25 ng/mL。通过该项研究得出在食品毒素含量检测过程中胶体金免疫层析法表现出极低的交叉反应率，展现出卓越的特异性和准确性。黄宝兵等[17]成功地运用盐霉素单克隆抗体技术，开发出一种新型的胶体金免疫层析试纸条。该试纸条能够快速检测动物源性食品中的盐霉素物质，其检测限达到了20μg/kg，仅需15分钟即可完成检测过程，该试纸条的假阳性率和假阴性率均为零，显示出其极高的检测精确性。
呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），是由黄色镰刀菌和禾谷镰刀菌产生的一种高毒性真菌代谢产物。它属于B族单端孢霉烯族化合物，它可以直接毒害细胞，影响免疫系统和生物体的遗传，高粱、小米、大豆等谷物及其相关产品和副产品为主要污染对象，并在全球各地有着广泛的分布。任淑艳等[18] 利用胶体金免疫层析试纸检测出黑龙江小麦和小麦粉中所含的DON平均含量分别为133 μg/kg和417μg/kg，检出率达到100%，最高检测值为970μg/kg。根据SILVAMV等[19]的研究结果，172个巴西小麦粉样品中检测到的DON检出率为77.9%，其中最高含量高达2794.6μg/kg。李向梅等人[20]成功运用柠檬酸三钠还原法制备出了胶体金颗粒，这种颗粒被用于牛奶中呕吐毒素残留的快速检测，成功地确定了检测的下限为100 µg/L。此外，他们运用喹诺酮类和庆大霉素单克隆抗体的比例混合标记技术，创新性地创建了胶体金免疫层析法。此法可同步检测牛奶中多达13种喹诺酮类和庆大霉素残留，检测下限低至20 ng/mL，实现了多项目同步检测的高效性。Lyubavinal A[21]运用胶体金标记的单克隆抗体层析技术，为牛奶中白喉毒素的检测提供了一种新方法，最低检测限达到了10 ng/mL。Wang Z等人[22]在优化技术的基础上，成功制备了糖皮质激素地塞米松的单克隆抗体，并与胶体金偶联，成功检测出乳样品中的地塞米松残留，其检出限低至0.3 ng/mL。胶体金免疫层析技术对食品中霉菌毒素的检测不断优化，展现出其在食品安全领域的广阔应用前景。
金黄色葡萄球菌在某些特定环境中生成肠毒素，这使其成为这种菌的主导致病因子。HuangS H[23]及其研究小组利用胶体金标记技术与免疫层析法进行结合，选用纳米金粒子作为标记材料，以此来制作试纸条，以检测畜产品（牛肉、猪肉）中金黄色葡萄球菌的含量，结果显示检测限达到了25 cfu/g。刘晶等人[24]成功研发了胶体金双特异性试纸条，试纸条上标记了针对金黄色葡萄球菌肠毒A（SEA）和B（SEB）的单克隆抗体。研究得出，该试纸条对SEA的响应范围为10~100 ng/mL，而对SEB的响应范围为1~100 ng/mL，这一成果成功地实现了金黄色葡萄球菌的快速定性半定量检测。
3 结论
在我国食品安全检测中，免疫层析技术检测范围相当广泛，包括粮油中的真菌毒素、动物源性食品中的抗生素残留、谷物蔬菜中的农药残留以及保健食品中的非法添加物等多个方面，展现出其在食品安全领域的重要应用价值。未来，该技术将更将致力于提升胶体金的质量，增强检测灵敏度以及开发多元化的检测技术，实时定量检测的实现也将是其发展的重要方向。这种简便高效、实用性强的检测方法，必将在未来的食品快速检测中占据更为核心的地位。
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