郑力凡-血人参胶束水凝胶投稿论文1-20241203

　　

载苗药血人参石油醚部位胶束水凝胶的制备及其促创面愈合研究

郑力凡，宋选飞¹，钟靓¹，肖思羽¹，赵婵¹，刘耀^1,2,3，徐剑^1,2,3，张永萍^1,2,3*

1.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025

2.贵州省民族药经皮给药制剂工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025

3.国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025

摘要：目的 制备一种载苗药血人参石油醚部位（Indigofera stachyodes Lindl. petroleum ether extract, ISs）的胶束水凝胶，对其促进慢性创面愈合效果进行评价。方法 采用单因素试验和正交试验优选载血人参石油醚部位胶束（ISs-M）的制备工艺，并将其携载于白及多糖水凝胶（Gel）中，制备载药胶束水凝胶（ISs-M-Gel）；对其进行质量评价并通过建立大鼠创伤性慢性创面模型，评价其促进慢性创面愈合效果。结果 ISs-M最优处方和制备工艺为ISs与泊洛沙姆188(P-188)药-载比为5%；PBS缓冲液加入量为10 mL；水化时间5 h。制备的ISs-M和ISs-M-Gel外观形态及稳定性良好。体内药效学研究显示ISs-M-Gel具有与成纤维细胞生长因子外用溶液相当的促进创伤性慢性创面愈合疗效。结论 制备的ISs-M-Gel工艺简单、稳定可行，对大鼠创伤性慢性创面具有较好的治疗效果。

关键词：血人参；血人参石油醚部位；载药胶束水凝胶；慢性创面；体内药效学研究

中图分类号：R 文献标志码：A

Preparation of micellar hydrogel from petroleum ether extract of Indigofera stachyodes from Miao medicine and its promotion of wound healing

ZHENG Lifan¹, SONG Xuanfei¹, ZHONG Liang¹, XIAO Siyu¹, ZHAO Chan¹, LIU Yao^1,2,3, XU Jian^1,2,3, ZHANG Yongping^1,2,3*

1.College of Pharmaceutical Sciences, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China

2. Guizhou Ethnic Medicine Transdermal Drug Delivery Preparation Engineering Technology Research Center, Guiyang 550025, China

3. National Engineering Research Center of Miao's Medicine, Guiyang 550025, China

Abstract: Objective To prepare a micelle hydrogel loaded with the petroleum ether extract of Indigofera stachyodes (ISs) and investigate its effect on promoting chronic wound healing. Methods The preparation process of ISs-loaded micelle (ISs-M) was optimised using single factor experiments and orthogonal experiments, and it was carried in Bletilla striata polysaccharide (BSP) hydrogel to prepare ISs-M-BSP-Hydrogel (ISs-M-Gel); The quality of ISs-M-Gel was evaluated and the effect of ISs-M-Gel in promoting chronic wound healing was evaluated by establishing the model of chronic traumatic wound in rats. Results The optimal formulation and preparation process of ISs was a 5% drug-load ratio between ISs and Poloxam 188 (P-188), the amount of PBS buffer was 10 mL, and the hydration time was 5 hours. The prepared ISs-M and ISs-M-Gel have good appearance and stability. In vivo pharmacodynamic studies have shown that ISs-M-Gel has a similar effect to topical fibroblast growth factor solution in promoting the healing of traumatic chronic wounds. Conclusion The ISs-M-Gel preparation process is simple, stable, and feasible; it has a good therapeutic effect on traumatic chronic wounds in rats.

Key words: Indigofera stachyodes Lindl.; the petroleum ether extract of Indigofera stachyodes; ISs-M-Gel; chronic wound; in vivo pharmacodynamic studies

引 言

创面愈合是一个复杂的生理过程，一般会经历止血、炎症、增殖和重塑四个阶段^[1]；而慢性创面会有持续炎症的发生，继而诱发氧化应激，造成组织损害、加重炎症反应、形成恶性循环，最终导致创面难以愈合^[2]，因此，给予一定的抗炎和抗氧化治疗成为一种新的治疗策略^[3-4]。

血人参是贵州苗族常用药，为豆科植物茸毛木蓝(Indigofera stachyodes Lindl.)的干燥根^[5]；富含黄酮和缩合鞣质类成分，具良好抗炎、抑菌、抗氧化和抗病毒等药理作用^[6-9]。茸毛木蓝地上和地下部分醇提物有体外抗氧化活性，与总黄酮含量呈量效关系^[10]。血人参醇提物及其不同萃取部位能抑制斑马鱼巨噬细胞向急性损伤部位迁移与聚集，以ISs和乙酸乙酯部位最为显著，适宜浓度下与地塞米松抗炎作用相当，具明显体外抑菌活性^[11-12]，对大鼠慢性创面有较好治疗效果^[13]；但其部分成分不稳定，对温度、pH敏感。

白及多糖(Bletilla striata polysaccharide, BSP)提取自传统中药白及，具抗炎、抗氧化、抗纤维化等生物学活性，无毒副作用、可生物降解、生物相容性好^[14]；BSP可通过发挥止血、加速创面异物清除、抑制炎症反应、抗氧化活性、调控胶原合成等作用促进创面愈合^[15-19]。

本研究制备载血人参石油醚部位胶束-白及多糖水凝胶剂，该制剂以胶束包载ISs，保护其成分、提高利用率；借助BSP水凝胶作为ISs-M的外用载体，在改善胶束溶液流动性、增加创面给药适应性的同时发挥BSP促进创面愈合疗效。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

LC-2030C 3D 型高效液相色谱仪，日本岛津制作所；UV-9000S紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；贝克曼激光粒度分析仪，美国贝克曼库尔特有限公司；H2050R高速冷冻离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；徕卡-2016型转轮式切片机，德国徕卡；SpectraMAX Plus384酶标仪，美谷分子仪器有限公司。

1.2 主要材料

血人参药材，批号 20210322，贵阳德昌祥药业有限公司，经贵州中医药大学张永萍教授鉴定为豆科木蓝属植物茸毛木蓝Indigofera stachyodes Lindl.的干燥根；表儿茶素，质量分数98.0%，批号PS012142，成都普思生物科技股份有限公司；汉黄芩素，质量分数98.0%，批号DSTDH002501，乐美天医药|德思特生物；硝酸铝（批号C15006512）、亚硝酸钠（批号20230301722），上海麦克林生化科技股份有限公司；乙腈，批号21040484，安徽天地高纯溶剂有限公司；泊洛沙姆188，批号A15IS212741，源叶生物；甲醇，批号20230714，天津市科密欧化学试剂有限公司；PBS缓冲液，批号23264147，Biosharp生物公司；丙三醇，批号20230823，天津市风船化学试剂科技有限公司；三乙醇胺，批号20220529，天津市致远化学试剂有限公司；卡波姆940，批号223062901，Solarbio；磷酸二氢钠，批号1010580101700，福晨（天津）化学试剂有限公司；甲醛，AR级，批号1340040101602，四川西陇科学有限公司；无水乙醇，AR级，批号100092680、二甲苯，AR级，批号10023418，国药集团化学试剂有限公司；苏木素染液，批号G1004，武汉塞维尔生物科技有限公司；伊红染液，批号YE2080，合肥博美生物科技有限责任公司；盐酸，AR级，批号7647-01-0，成都市科隆化学品有限公司；中性树胶，批号BL704A，Biosharp生物公司；Rat IL-6 ELISA KIT（96 Test，批号ZC-36404）、Rat TNF-α ELISA KI（96 Test，批号ZC-37624），上海茁彩生物科技有限公司；总蛋白（TP）测定试剂盒（批号A045-2-1）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（批号A001-1-2）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（批号A003-1-2），南京建成生物工程研究所。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠，体重180~220 g，购自贵州中医药大学实验动物研究所，许可证号：SCXK（黔）2021-0003。动物实验符合动物实验伦理学要求，经贵州中医药大学动物伦理委员会审查后批准，符合3R原则。

2 方法与结果

2.1 ISs的制备

称取血人参药材2.4 kg，适当切断，回流提取三次，第一次加10倍量90%乙醇回流提取3 h，过滤；第二次加10倍量60%乙醇回流提取2 h，过滤；第三次加10倍量30%乙醇回流提取1 h，过滤；合并滤液，减压回收乙醇并浓缩至一定浓度，干燥后得到血人参乙醇浸膏粉。取适量水分散血人参乙醇浸膏粉，用等体积石油醚萃取3次，合并萃取液、减压回收溶剂，干燥后得到石油醚萃取部位7.0329 g。

2.2 ISs体外分析方法的建立

前期研究显示ISs发挥促进创面愈合疗效主要成分为黄酮类化合物^[20]，故建立以表儿茶素为对照品的紫外-可见分光光度法和以汉黄芩素为代表成分的高效液相色谱分析方法。

2.2.1 紫外-可见分光光度法

2.2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取表儿茶素对照品2.78 mg置10 mL容量瓶，加适量甲醇超声溶解后定容。

2.2.1.2 供试品溶液的制备

取适量ISs置10 mL容量瓶，加适量甲醇超声溶解后定容。

2.2.1.3 测定波长的选择

精密吸取“2.2.1.1”项下表儿茶素对照品溶液和“2.2.1.2”项下供试品溶液，用硝酸铝-亚硝酸钠经典显色法显色处理后进行全波长扫描，确定最大吸收波长为490 nm。

图1 ISs-表儿茶素全波长扫描结果

Fig. 1 Full wavelength scanning results of Is-epigallocatechin

2.2.1.4 线性关系

精密吸取0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.2 mL“2.2.1.1”项下的表儿茶素对照品溶液，分别置于10 mL容量瓶，各加60%乙醇至5 mL，精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加入4 %氢氧化钠溶液4 mL，加60%乙醇定容，摇匀，静置15 min后于490 nm下测定吸光度。以表儿茶素浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），得表儿茶素线性回归方程Y=26.17X-0.0067，R=0.999；线性范围0.00278 mg/mL~0.03336 mg/mL。表明表儿茶素在线性范围内线性关系良好。

图2 总黄酮线性关系

Fig. 2 Linear relationship of total flavonoids

2.2.1.5 精密度

精密吸取表儿茶素对照品溶液0.3 mL，按“2.2.1.4”项下显色处理，在490 nm波长处测定吸光度，连续6次，其RSD值为0.0427%，符合要求，仪器精密度良好。

2.2.1.6 重复性

按“2.2.1.2”项下制备6份供试品溶液，加甲醇配制为质量浓度为8.17 mg/mL的供试品溶液，分别精密吸取1 mL，按“2.2.1.4”项下显色处理，在490 nm波长处测定吸光度，其RSD值为1.7516%，符合要求，表明该方法重复性良好。

2.2.1.7 稳定性

按“2.2.1.2”项下制备供试品溶液，加甲醇配制为质量浓度为8.15 mg/mL的供试品溶液，精密吸取1 mL，按“2.2.1.4”项下显色处理，在490 nm波长处测定吸光度，每5 min测定1次，连续测定12次，其RSD值为0.6813%，符合要求，表明供试品溶液在1 h内稳定性良好。

2.2.1.8 加样回收率

精密称取5份ISs（总黄酮含量为0.3227 mg），分别置于10 mL容量瓶中，各加入0.2 mg表儿茶素对照品，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1 mL，按“2.2.1.4”项下显色处理，在490 nm波长处测定吸光度，其RSD值为0.3145%，符合要求，表明在建立的方法中，表儿茶素的回收率良好。

2.2.2 高效液相色谱法

2.2.2.1色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱；流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱：0~60 min，10~55%乙腈；60~75 min，55~10%乙腈；体积流量为1 mL/min；检测波长为210 nm，柱温30℃；进样10 μL。

2.2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取汉黄芩素对照品10.07 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至1.007 mg/mL，4℃保存。

2.2.2.3 供试品溶液的制备

精密称取ISs 10.04 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至1.004 mg/mL。

2.2.2.4 专属性考察

取对照品溶液和供试品溶液按“2.2.2.1”项下色谱条件进行分析，色谱图见图3。在该色谱条件下，供试品溶液和对照品溶液中汉黄芩素的色谱峰具有相同保留时间，且能实现完全分离。

图3 汉黄芩素对照品（A）、ISs供试品（B）的HPLC图

Fig. 3 HPLC of Wogonin standard (A) and ISs sample (B)

2.2.2.5 线性关系考察

精密吸取0.005 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL“2.2.2.2”项下的汉黄芩素对照品溶液，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释，得到0.5035 µg/mL、5.0350 µg/mL、10.0700 µg/mL、20.1400 µg/mL、40.2800 µg/mL、60.4200 µg/mL、80.5600 µg/mL汉黄芩素系列质量浓度的对照品溶液，按“2.2.2.1”项下色谱条件进样分析，测定其峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（X），待测成分峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得汉黄芩素线性回归方程Y=71141X-14003，R=0.9999；线性范围为0.5035 µg/mL ~80.5600 µg/mL。由此可知，汉黄芩素在线性范围内线性关系良好。

2.2.2.6 精密度考察

精密吸取汉黄芩素对照品溶液，用甲醇定容至10 mL，并按“2.2.2.1”项下色谱条件进行分析，重复6次，以随行线性回归方程计算其中汉黄芩素的实测质量浓度，并计算其RSD值，其RSD值为1.4921%，符合要求，仪器精密度良好。

2.2.2.7 重复性考察

精密吸取ISs供试品溶液1 mL于2 mL容量瓶中，用甲醇稀释至0.502 mg/mL，按“2.2.2.1”项下色谱条件进行分析，重复6次，测定其峰面积并计算汉黄芩素含量，汉黄芩素含量依次为26.42521 µg/mL、25.30849 µg/mL、25.84621 µg/mL、25.49039 µg/mL、26.00299 µg/mL、25.24686 µg/mL，其RSD值为1.7726%，符合要求，表明该方法重复性良好。

2.2.2.8 稳定性考察

取同一批ISs，按“2.2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.2.1”项下色谱条件在溶液制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h时分别进样分析，以随行线性回归方程计算其中汉黄芩素的实测含量并计算RSD值；其RSD值为2.1106%，符合要求，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.2.9 加样回收率考察

精密称取6份已测定指标成分含量的ISs样品并加入适量对照品，按“2.2.2.3”项下方法处理样品制备供试品溶液，并按“2.2.2.1”项下色谱条件进行分析，以随行线性回归方程计算其中汉黄芩素的加样回收率及其RSD值；汉黄芩素平均回收率为104.30%，RSD值为1.1426%。

2.3 ISs-M的制备

称取120 mg泊洛沙姆188和12 mg ISs于200 mL茄形瓶中，加入12 mL甲醇使之完全溶解，50℃旋蒸挥去溶剂，形成薄膜，加入10 mL PBS缓冲溶液（pH=7），轻轻振荡使膜溶入其中，封口，静置6 h，过0.45 µm微孔滤膜，即得。

2.4 单因素考察ISs-M的处方工艺

为考察不同载药量、水化体积、水化时间、旋蒸温度对ISs-M粒径和包封率的影响，本研究以总黄酮作为ISs-M含量测定指标成分，粒径和包封率为评价指标，按“2.3”项下方法制备ISs-M，评价各因素对ISs-M粒径和包封率的影响。

选取的载药量分别为5%、10%、20%、30%、40%、50%；PBS缓冲溶液的水化体积分别为6 mL、7 mL、8 mL、9 mL、10 mL、11 mL；水化时间分别为4 h、5 h、6 h、7 h、8 h；旋蒸温度分别为40℃ 、50℃、60℃、70℃。（具体操作为：取1 mL胶束溶液于2 mL容量瓶，加甲醇至刻度，超声30 min（35 Hz，50%功率），精密吸取1 mL 40℃水浴蒸干后用1 mL甲醇复溶，按“2.2.1”项下紫外-可见分光光度法测定）。

2.4.1 不同载药量

不同载药量制备的ISs-M粒径分布在95 nm~125 nm之间，分散均匀，包封率在43.86%~72.54%之间，以20%药-载比时封率最高。

表1 不同载药量单因素考察结果

Table 1 Results of single factor analysis of different drug loadings

Item	Diameter (nm)	PD Index	包封率（%）
5%	110.8667±1.8425	0.2358±0.0033	69.83
10%	108.6000±1.0000	0.2233±0.0113	66.15
20%	94.6500±1.0483	0.2385±0.0008	72.54
30%	101.5000±0.6986	0.0790±0.0059	61.81
40%	116.3000±1.0450	0.0292±0.008	43.86
50%	123.1833±1.6018	0.0000	47.02

2.4.2 不同水化体积

不同水化体积制备的ISs-M粒径分布在90 nm~113 nm之间，分散均匀，包封率在51.49%~75.06%之间，以水化体积为8 mL时包封率最高。

表2 不同水化体积单因素考察结果

Table 2 Results of single-factor investigation of different hydration volumes

Item	Diameter (nm)	PD Index	包封率（%）
6 mL	112.4667±0.7090	0.1888±0.0114	67.55
7 mL	94.7667±0.7146	0.2362±0.0025	51.49
8 mL	99.1667±1.4989	0.2065±0.0134	75.06
9 mL	107.5500±0.9524	0.2365±0.0028	72.35
10 mL	94.6500±1.0483	0.2385±0.0008	72.54
11 mL	92.1667±0.9158	0.2108±0.0188	58.28

2.4.3 不同水化时间

不同水化时间制备的ISs-M粒径分布在118 nm~127 nm之间，分散均匀，包封率在64.16%~77.16%之间，以水化时间为5 h时包封率最高。

表3 不同水化时间单因素考察结果

Table 3 Results of single-factor investigation of different hydration times

Item	Diameter (nm)	PD Index	包封率（%）
4 h	119.1167±0.7387	0.1962±0.0108	70.76
5 h	122.8167±0.9968	0.1775±0.0129	77.16
6 h	126.9833±1.1686	0.1692±0.0155	73.41
7 h	122.2167±1.6786	0.1505±0.0107	69.67
8 h	118.3000±1.0807	0.1918±0.0100	64.16

2.4.4 不同旋蒸温度

不同旋蒸温度制备的ISs-M粒径分布在118 nm~125 nm之间，分散均匀，包封率在64.10%~77.16%之间，以旋蒸温度为50℃时包封率最高。

表4 不同旋蒸温度单因素考察结果

Table 4 Results of single-factor investigation of different rotary evaporation temperatures

Item	Diameter (nm)	PD Index	包封率（%）
40℃	124.5333±1.2469	0.2260±0.0089	54.68
50℃	122.8167±0.9968	0.1775±0.0129	77.16
60℃	120.1167±0.4215	0.2007±0.0051	71.74
70℃	118.8000±1.0000	0.1932±0.0153	64.10

2.5 正交试验优化处方工艺

为进一步筛选ISs-M的制备工艺和处方，本实验采用正交试验设计法优化其制备工艺和制备处方。单因素考察实验结果显示：载药量（A）、水化时间（B）、水化体积（C）对ISs-M的粒径和包封率均有影响，影响大小依次为A＞B＞C；方差分析结果显示载药量对载药胶束包封率具有显著影响，其余因素无显著影响。综合分析确定载药胶束的制备工艺为A₁B₂C₃，即载药量5%，水化时间5 h，水化体积10 mL。

表5 因素水平

Table 5 Factor levels

	因素
水平	A：载药量（%）	B:水化时间（h）	C:水化体积（mL）
1	5	4	8
2	10	5	9
3	20	6	10

表6 正交实验设计结果

Table 6 Results of the orthogonal experiment design

序号	因素									粒径（nm）		PDI			包封率（%）
	A				B			C
1	1			1			1			134.9500±0.7036		0.2092±0.0074				68.46
2	1			2			2			153.7000±0.5404		0.2128±0.0061				73.79
3	1			3			3			144.6167±1.2384		0.2322±0.0066				77.17
4	2			1			3			124.1333±1.2754		0.1795±0.0173				65.58
5	2			2			1			120.2000±0.4382		0.1962±0.0061				68.27
6	2			3			2			115.7000±0.9940		0.2132±0.0111				62.77
7	3			1			2			113.3000±1.3740		0.1737±0.0172				57.44
8	3			2			3			118.5000±1.0040		0.1337±0.0408				66.78
9	3			3			1			113.0167±1.0759		0.2143±0.0105				62.88
k1	73.14			63.82			66.54
k2	65.54			69.62			64.67
k3	62.37			67.61			69.84
R	10.77			5.79			5.18
最优顺序		A＞B＞C
最优水平			A1			B2			C3
最优组合			A1B2C3

表7 方差分析表

Table 7 ANOVA table

方差来源	离差平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
A	183.895	2	91.947	39.32	0.025	*
B	51.801	2	25.900	11.076	0.083	无差异
C	41.229	2	20.614	8.816	0.102	无差异
误差	4.677	2	2.338

2.6 ISs-M的表征

2.6.1 ISs-M形态学

自然光下ISs-M为淡黄色~棕黄色透明溶液，具丁达尔效应。将20 μL样品滴至覆有碳膜的铜网上，室温晾干后使用透射电镜观察胶束轮廓形态，结果如图4所示：ISs-M呈类球形，规则圆整，分布较均匀。

图4 载药胶束透射电镜结果

Fig. 4 Results of the ISs transmission electron microscope

2.6.2 ISs-M放置稳定性

以粒径大小和PDI考察ISs-M的放置稳定性。按“2.4”项下筛选出的最佳处方工艺制备ISs-M，每天固定时间点测定其粒径和PDI（4℃，避光），连续7天，考察其稳定性，结果如表8所示，显示ISs-M在7天内稳定性良好。

表8 载药胶束放置稳定性

Table 8 Placement stability of ISs-M

Time (d)	Diameter (nm)	PD Index
1	122.5333±0.6377	0.2372±0.0013
2	123.5333±0.9791	0.2377±0.0010
3	125.5833±1.5715	0.2385±0.0008
4	126.9833±0.5981	0.2372±0.0028
5	129.2000±1.2100	0.2362±0.0037
6	129.5833±1.7394	0.2365±0.0033
7	131.7667±1.0501	0.2373±0.0019

2.7 ISs-M-Gel的制备及其评价

2.7.1 ISs-M-Gel的制备

2.7.1.1 ISs-M的浓缩

取15 mL ISs-M溶液于超滤离心管（15mL 3KD）中，冷冻离心（-4 ℃，5000 r/min，30 min/次）浓缩至所需浓度后4℃保存备用，如表9所示浓缩对胶束粒径无明显影响）

表9 载药胶束浓缩前后粒径情况

Table 9 Particle size of ISs-M before and after concentration

Time (d)	Diameter (nm)	PD Index
浓缩前	124.8500±1.2373	0.2322±0.0063
浓缩后	131.1667±0.5922	0.2332±0.0046

2.7.1.2 空白ISs-M-Gel的制备

称取0.42 g白及多糖完全溶解于12.6 mL空白胶束溶液中，得到溶液A，另取0.1 g卡波姆940溶于上述溶液中，密封溶胀过夜后加入1.4 mL甘油搅拌均匀，用三乙醇胺调pH至7，即得。

2.7.1.3 ISs-M-Gel的制备

称取0.42 g白及多糖完全溶解于12.6 mL载药胶束溶液中，得到溶液A，另取0.1 g卡波姆940溶于上述溶液中，密封溶胀过夜后加入1.4 mL甘油搅拌均匀，用三乙醇胺调pH至7，即得。

2.7.2 ISs-M-Gel的评价

2.7.2.1 ISs-M-Gel外观与形态

ISs-M-Gel呈淡黄色~棕黄色、成型性较好、均匀细腻、易涂抹、黏附性较好、不厚重，易擦去。

图5 载药胶束水凝胶形态

Fig. 5 Morphology of ISs-M-Gel

2.7.2.2 ISs-M-Gel的粘度与pH

取适量ISs-M-Gel分别于50 mL离心管，用玻璃棒搅匀后测定粘度，平行三次，其平均粘度为38164 mpa•s。使用pH计测定其pH，平行三次，样品的酸碱度为7.13（表10）。

表10 载药胶束水凝胶pH与粘度测定结果

Table 10 Results of pH and viscosity determination of ISs-M-Gel

项目	pH	粘度 (mpa•s)
ISs-M-Gel	7.13±0.01	38164±6.56

2.7.2.3 ISs-M-Gel的放置稳定性

以外观性状、pH和粘度考察ISs-M-Gel放置稳定性。按已确定的最佳处方工艺制备ISs-M-Gel，每天固定时间点测定pH和粘度（4℃，避光），连续30天。由表11可知，载药胶束水凝胶在30天内稳定性良好。

表11 载药胶束水凝胶稳定性考察结果

Table 11 Results of the stability test of ISs-M-Gel

Time (d)	外观性状	pH	粘度 (mpa•s)
0	淡黄色，未分层，均匀细腻	7.13±0.01	38164.00±6.56
3	淡黄色，未分层，均匀细腻	7.12±0.01	37993.00±6.08
7	淡黄色，未分层，均匀细腻	7.13±0.01	39702.33±6.66
14	淡黄色，未分层，均匀细腻	7.18±0.01	39779.67±5.03
21	淡黄色，未分层，均匀细腻	7.10±0.01	40017.00±6.24
30	淡黄色，未分层，均匀细腻	7.13±0.02	39099.00±3.61

2.7.2.4 ISs-M-Gel的皮肤刺激性

将5只SD大鼠后背部皮肤脱毛后饲养24 h，划分脱毛区域为A (ISs-M-Gel)、B (Blank-M-Gel)、C (ISs-M)、D (Blank-M)、E (PBS)区，每天固定时间涂抹给药，连续21天，并于不同时间拍照记录各区域皮肤状态，计分与评价标准见表12、表13。由皮肤刺激性实验结果（表14、图6）可知，载药胶束水凝胶、空白胶束水凝胶、载药胶束以及空白胶束均对SD大鼠皮肤无刺激性。

表12 SD大鼠皮肤刺激性计分标准

Table 12 Scoring criteria for skin irritation in SD rats

红斑形成	积分	水肿形成	积分
无红斑	0	无水肿	0
勉强可见	1	勉强可见	1
中度红斑	2	中度水肿（明显隆起）	2
严重红斑	3	严重水肿（隆起1mm,轮廓清晰）	3

表13 SD大鼠皮肤刺激性评价标准

Table 13 Skin irritation evaluation criteria for SD rats

分值	评价
0-1	无刺激
2-3	轻微刺激
4-5	中度刺激
5-6	重度刺激

表14 SD大鼠皮肤刺激性实验结果

Table 14 Results of the skin irritation test on SD rats

时间 (d)	1号	2号	3号	4号	5号
0	0	0	0	0	0
3	0	0	0	0	0
7	0	0	0	0	0
14<, /p>	0	0	0	0	0
21	0	0	0	0	0

图6 SD大鼠皮肤刺激性实验结果

Fig. 6 Results of the skin irritation test on SD rats

2.7.2.5 ISs-M-Gel的体外释放

（1）不同释放介质平衡溶解度考察

分别取1 mL不同释放介质于5 mL离心管，加入过量血人参石油醚浸膏，使其始终保持有沉淀存在，超声10 min后置37℃恒温振荡箱中振荡24 h，使其充分溶解。将离心管中的药物溶液以5000 r/min离心10 min，取上清液0.2 mL至10 mL容量瓶，加各释放介质摇匀后定容，进高液测定。由不同释放介质平衡溶解度考察结果（表15）可知，血人参石油醚萃取物在70%无水乙醇—生理盐水中的溶解性最好。

表15 不同释放介质平衡溶解度考察结果

Table 15 Results of equilibrium solubility investigations for different release media

溶剂	C (mg/mL)
50%无水乙醇-生理盐水	0.1259
60%无水乙醇-生理盐水	0.1664
70%无水乙醇-生理盐水	0.1797
生理盐水	0.0137
50%无水乙醇-PBS溶液	0.0517
60%无水乙醇-PBS溶液	0.0642
70%无水乙醇-PBS溶液	0.1052

（2）体外释放性能

药物释药性能是考察水凝胶作为缓控释制剂应用的一项重要指标。本研究采用最优处方和工艺制备了ISs-M-Gel，其体外累计释放率结果（图7）显示ISs-M-Gel中指标成分汉黄芩素在24 h后达到恒速释放，累计释放率可达90%以上。采用Origin软件对其累积释放数据与零级方程、一级方程和Higuchi平方根方程进行拟合，结果显示（表16）ISs-M-Gel中的指标成分汉黄芩素释放规律复合一级动力学，表明胶束水凝胶可作为ISs的药物储库发挥缓释作用。

图7 载药胶束水凝胶累积透过率实验结果

Fig. 7 Results of the cumulative permeability experiment of AA

表16 汉黄芩素释放数据拟合情况

Table 16 Fitting of wogonin release data

模型	模型拟合方程	R2
零级动力学拟合方程	Mt=0.77t+54.20	0.4936
一级动力学拟合方程	Mt=93.12（1-e-0.20t）	0.9949
Higuchi平方根拟合方程	Mt=8.59t1/2+36.35	0.6900

2.8 ISs-M-Gel体内药效评价

2.8.1 创伤性慢性创面大鼠模型的建立

SD大鼠适应性喂养一周，备皮，麻醉后在其后背部手术制作一个2.5 cm×2.5 cm大小的创口，肌肉注射青霉素钾和醋酸氢化可的松，其中青霉素钾 4000 U/次，1次/天，连续肌注4天：醋酸氢化可的松 80 mg/kg，1次/天，连续肌注7天并记为第0天，造模完成次日开始观察创面情况，记为观察第1天。

2.8.2 分组

80只SD大鼠随机分为5组，每组16只，即模型组、阳性对照组（成纤维细胞生长因子外用溶液）、ISs组、空白胶束水凝胶组（Blank-M-Gel）、ISs-M-Gel组。

2.8.3 创面愈合率

采用Image J软件分析3、7、14、21 d时各组动物创面伤口面积，以第1天伤口面积作为伤口初始面积，计算创面愈合率。由图8、表17可知，各组大鼠创面随时间推移愈合，治疗3~7天后，各组大鼠创面愈合率无明显差异；治疗14~21天后，与模型组相比，阳性药组、ISs组、Blank-M-Gel组和ISs-M-Gel组创面愈合率显著提高（P＜0.01）。

图8 不同时间点各组大鼠创面修复情况

Fig. 8 Wound healing in rats at different time points

表17 不同时间点各组创面愈合率

Table 17 Wound healing rate of each group at different time points

分组	第3天	第7天	第14天	第21天
模型组	31.29±2.31	61.76 ±3.40	71.74 ±2.02	84.98 ±0.61
阳性药组	34.86 ±1.58	63.88 ±3.74	81.06 ±1.78**	90.71± 3.26**
ISs组	36.99 ±4.69	66.20 ±3.49	84.72 ±1.86**	91.10 ±1.33**
Blank-M-Gel	34.14 ±2.81	63.77 ±3.74	83.72 ±4.98**	89.88 ±2.79**
ISs- M-Gel	38.34 ±3.57	66.23 ±3.32	85.69 ±1.23**	92.33± 0.47**

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.8.4 再生组织HE染色

药物干预后，对第3、7、14、21d创面再生组织进行HE染色分析，结果如图9所示，治疗14 d后，与模型组相比，ISs-M-Gel组和阳性药组修复程度最好，主要表现为阳性细胞浸润减少，新生毛细血管增多以及胶原纤维形成明显等，其中，ISs-M-Gel组胶原纤维排列更整齐、紧密。ISs组和Blank-M-Gel组皮肤修复程度较ISs-M-Gel组和阳性药组差。结果表明各治疗组对慢性创面均具修复作用，而ISs-M-Gel具有与阳性药相当的治疗作用。

注：(×400) 中性粒细胞（↑）成纤维细胞（↑）新生毛细血管（↑）坏死细胞碎片（↑）出血（↑）

图9 皮肤再生组织在第3 d、7 d、14 d和21 d的HE染色图像

Fig. 9 HE staining images of skin regenerating tissue at 3 d, 7 d, 14 d and 21 d

2.8.5 对炎症因子的影响

药物干预3、7、14、21 d后分别取各组大鼠4只，腹主动脉取血，-20℃离心后取血清采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定炎症因子IL-6和TNF-a。实验结果如表18、19所示，与模型组相比，各给药组均有抑制炎症反应的作用，其中在治疗7 d和14 d后ISs-M-Gel组和阳性药组大鼠血清中的IL-6与TNF-a显著降低（P＜0.01）。而在治疗21 d后，ISs 组、阳性药和ISs-M-Gel组大鼠血清中的TNF-a明显降低（P＜0.01），阳性药和ISs-M-Gel组大鼠血清中的IL-6均降低；其中阳性药（P＜0.01）降低程度较ISs-M-Gel（P＜0.05）明显。该结果表明，阳性药、ISs、Blank-M-Gel和ISs-M-Gel可能具有抑制炎症反应发生的作用，并以ISs-M-Gel和阳性药的抑制作用最强，ISs相对次之。

表18 各治疗组对细胞炎症因子IL-6的影响结果（pg/mL, n=4）

Table 18 Results of the effect of each treatment group on the inflammatory cytokine IL-6 (pg/mL, n=4)

组别	第3天	第7天	第14天	第21天
模型组	29.235±3.560	33.259±4.106	27.281±3.289	24.143±2.935
阳性药组	26.304±5.616	25.592±2.225**	20.823±2.491**	17.276±2.387**
ISs	27.580±3.352	28.350±2.309*	22.140±3.353*	21.430±2.073
Blank-M-Gel	27.854±6.756	28.339±3.160*	25.362±2.001	21.881±3.701
ISs-M-Gel	25.365±3.781	26.537±2.714**	20.222±2.773**	18.816±2.489*

注：与模型组相比，*P <0.05，**P <0.01。

表19 各治疗组对细胞炎症因子TNF-α的影响结果（pg/mL, n=4）

Table 19 Results of the effect of each treatment group on the inflammatory cell factor TNF-α (pg/mL, n=4)

组别	第3天	第7天	第14天	第21天
模型组	37.816±5.304	41.273±4.774	35.330±4.194	33.228±4.855
阳性药组	34.515±5.296	33.515±2.059**	27.369±3.272**	23.572±3.507**
ISs	36.291±4.079	35.838±2.969*	30.153±1.669*	25.383±3.132**
Blank-M-Gel	37.313±3.208	36.360±2.495*	32.237±3.526	28.166±3.297
ISs-M-Gel	34.748±4.311	33.541±1.943**	27.069±2.100**	24.347±2.416**

注：与模型组相比，*P <0.05，**P <0.01

2.8.6 对氧化因子的影响

药物干预3、7和14 d后分别取各组大鼠4只，取与造模面积大小一致的再生皮肤组织，匀浆后进行氧化因子SOD、MDA检测。

SOD实验结果如表20所示，治疗7 d后，与模型组相比，阳性药组创面再生皮肤组织中SOD明显升高，差异极显著（P＜0.01）；ISs-M-Gel组SOD升高，差异显著（P＜0.05）。治疗14 d和21 d后，与模型组相比，阳性药组、ISs-M-Gel组创面再生皮肤组织中SOD明显升高，差异极显著（P<0.01）；ISs组中SOD升高，差异显著（P<0.05）。MDA实验结果如表21所示，在治疗14 d后，与模型组相比，阳性药组、ISs-M-Gel组创面再生皮肤组织中MDA明显降低，差异极显著（P <0.01）；ISs组、Blank-M-Gel组再生皮肤组织中MDA降低，差异显著（P <0.05）。在治疗21 d后，与模型组相比，阳性药组、ISs-M-Gel组再生皮肤组织中MDA明显降低，差异极显著（P <0.01）；ISs组中MDA降低，差异显著（P <0.05）。

以上结果表明在给药治疗后，创伤性慢性创面模型大鼠的创面再生组织中MDA水平降低，SOD水平升高，即氧化应激反应得到有效缓解，其中以阳性药组和ISs-M-Gel组缓解程度最显著，ISs组较显著，Blank-M-Gel组相对次之。

表20 各治疗组对氧化因子SOD的影响结果（U/mgprot, n=4）

Table 20 Results of the effect of the treatment groups on the antioxidant factor SOD (U/mgprot, n=4)

组别	第3天	第7天	第14天	第21天
模型组	156.75±13.80	163.49±9.90	175.02±8.49	185.04±8.02
阳性药组	176.81±17.02	185.82±7.50**	208.96±12.72**	225.49±16.37**
ISs	165.26±15.96	169.16±10.41	191.30±7.17*	207.15±8.29*
Blank-M-Gel	158.57±16.63	167.07±12.21	184.19±9.20	200.04±9.69
ISs-M-Gel	171.63±18.56	181.16±10.76*	210.55±8.19**	226.71±15.75**

注：与模型组相比，*P <0.05，**P <0.01。

表21 各治疗组对氧化因子MDA的影响结果（nmol/mgprot, n=4）

Table 21 Results of the effect of the treatment groups on the oxidative factor MDA (nmol/mgprot, n=4)

组别	第3天	第7天	第14天	第21天
模型组	6.485±0.895	6.333±0.674	5.891±0.854	5.383±0.629
阳性药组	6.040±1.159	5.800±0.320	4.509±0.309**	3.821±0.559**
ISs	6.213±1.008	5.904±0.647	4.861±0.638*	4.281±0.387*
Blank-M-Gel	6.339±0.200	6.174±0.692	4.958±0.366*	4.639±0.739
ISs-M-Gel	5.999±0.629	5.760±0.841	4.582±0.728**	3.612±0.348**

注：与模型组相比，*P <0.05，**P <0.01。

2.8.7 再生组织CD31表达情况

实验结果如表22、图10所示，不同时间点各实验组均有CD31阳性表达，与模型组相比，阳性药组、ISs-M-Gel组、ISs组大鼠再生皮肤组织中的CD31阳性显著增多（P<0.01），其中在治疗21天，ISs-M-Gel组明显优于其余各组。表明ISs-M-Gel组和ISs组均可能通过增加再生组织中血管的新生以加速创面愈合，其中ISs-M-Gel组最好、ISs组次之。

表22不同时间点各实验组再生组织CD31阳性面积占比（n=3）

Table 22 Percentage of positive area of CD31 in regenerated tissue in each experimental group at different time points (n=3)

组别	第3天	第7天	第14天	第21天
模型组	3.0645±4.2508	1.6529±0.9096	2.8234±1.1159	1.8523±1.1959
阳性药组	6.2857±1.4613	7.4813±0.9326**	7.2635±0.8241**	7.2127±0.8915**
ISs	8.0553±1.0757	8.2886±1.1151**	7.7064±1.0681**	6.1788±1.4698**
Blank-M-Gel	5.7721±2.0970	3.6453±1.7298	4.7317±1.2379*	4.3301±2.6150
ISs-M-Gel	9.8353±1.3759	8.2300±0.7280**	7.8303±0.7834**	8.6011±1.0992**

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

注：CD31表达（↑）

图10 不同时间点皮肤再生组织CD31免疫组化图片

Fig. 10 Immunohistochemical images of skin regenerative tissue CD31 at different time points

2.8.8 再生组织胶原纤维沉淀情况

实验结果如图11所示，不同时间点各实验组均有胶原纤维沉积，且与治疗时间呈正相关。治疗第14天，与模型组相比，阳性药组与ISs-M-Gel组再生皮肤纤维组织沉积更密集，其中，ISs-M-Gel组表达面积百分比是模型组的2.09倍、ISs组的1.72倍、Blank-M-Gel组的1.78倍（表23）。结果表明，ISs-M-Gel组具有比ISs和Blank-M-Gel更优的促胶原纤维形成疗效。

表23 不同时间点各实验组再生皮肤纤维组织表达面积百分比（n=3）

Table 23 Percentage of regenerated skin fibre tissue expression area in each experimental group at different time points (n=3)

组别	第3天	第7天	第14天	第21天
模型组	0.99±0.86	6.35±0.39	11.98±6.49	25.66±0.35
阳性药组	1.37±0.82	7.90±1.18	24.25±3.39**	26.49±4.79
ISs	2.22±1.65	8.20±6.49	14.57±3.68	26.56±2.81
Blank-M-Gel	2.32±1.10	8.05±1.52	14.07±4.56	26.49±2.07
ISs-M-Gel	3.03±2.04	8.47±0.78	25.13±3.90**	26.95±13.65

注：与模型组相比，*P <0.05，**P <0.01

注：胶原纤维（↑）

图11不同时间点皮肤再生组织Masson染色图片

Fig. 11 Masson's trichrome staining of skin regenerative tissue at different time points

3 讨论

本研究在单因素考察的基础上正交试验设计筛选出最优的ISs-M，即ISs与泊洛沙姆188(P-188)药-载比为5%；PBS缓冲液加入量为10 mL；水化时间5 h；以胶束包载ISs，保护其成分、提高利用率。并借助BSP水凝胶作为ISs-M的外用载体，在改善胶束溶液流动性，增加创面给药适应性的同时发挥BSP促进创面愈合疗效。

体内药效结果显示，ISs-M-Gel对大鼠创伤性慢性创面具有较好的治疗作用，主要表现为阳性细胞浸润减少、新生毛细血管的增多以及胶原纤维形成明显等；ISs-M-Gel可能具有抑制炎症反应发生的作用，通过增加再生组织中血管的新生加速创面愈合。

综上，苗药血人参因其优良的抗炎和抗氧化活性是目前创面愈合治疗具有潜力的候选药物，将其石油醚部位载入胶束水凝胶后能在创面愈合前期减少慢性创面炎性细胞浸润，降低相关炎症因子水平发挥抗炎作用、减少氧化应激损伤以缩短炎症周期，愈合后期促进毛细血管和纤维细胞的新生以改善创面愈合质量，但其中具体调控机制和皮肤相关附属器的再生情况还需进一步系统研究。

此外，本研究还存在其他不足之处。关于载药胶束在创面组织及细胞中的穿透、分布情况本文并未开展相关实验，后期可针对其展开深入的系统研究，为胶束载药技术优势提供理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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