基于生物标签模式探究枳壳的治疗潜能及作用机制

　　

基于生物标签模式探究枳壳的治疗潜能及作用机制

周珊珊

（遵义市中医院，贵州遵义，563000）

摘要

目的：基于生物标签探究中药枳壳治疗潜能及作用机制。方法：通过知网及TCMSP等数据库，查找文献并收集枳壳中所含化学成分。将枳壳的中文名称导入Pubchem及Chemicalbook数据库下载枳壳化学成分的二维结构并以mol格式保存。将每个成分的二维结构导入SwissTargetPrediction数据库，并筛选枳壳化学成分对应的靶点，利用韦恩软件去重后把靶点导入DAVID数据库中探索其功能和通路。最后将通路导入CTD数据库筛选出关联疾病，同时收集预测疾病对应的靶点，再将STP与CTD数据库获得靶点取交集。利用Cytoscape软件构建“药味－成分－靶点－疾病”网络进行分析。结果：筛选出枳壳中的化学成分14个,（橙皮苷、葡萄内酯、柚皮素、那可汀、去甲肾上腺素、辛弗林、十五烷酸、癸酸等），根据靶点关联性大小，最终确认6个成分。涉及核心靶点19个。靶点对应的通路为5条。结论：通路涉及的疾病13种。基于生物标签模式预测枳壳的治疗潜能及作用机制与文献报道的一致，表明利用生物标签探究中药的治疗潜能及作用机制具有可行性，同时也为枳壳的新临床应用提供一定研究基础。

关键词：枳壳；生物标签模式；成分；靶点；疾病

作者简介：周珊珊（1992-），女，贵州遵义人，主管中药师，主要从事中药质量标准研究

To explore the therapeutic potential and mechanism of Poncirus trifoliata based on biomarker model

ZhouShanshan

(Zunyi Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zunyi, Guizhou 563000, China)

Abstract

Objective:To explore the therapeutic potential and mechanism of action of the traditional Chinese medicine Poncirus trifoliata based on bio-labeling.Methods: Through databases such as CNKI and TCMSP, literature was searched and the chemical components contained in Poncirus trifoliata were collected. The Chinese name of Poncirus trifoliata was imported into Pubchem and Chemicalbook databases to download the two-dimensional structures of the chemical components of Poncirus trifoliata and save them in mol format. The two-dimensional structure of each component was imported into the SwissTargetPrediction database, and the corresponding targets of the chemical components of Poncirus trifoliata were screened. After removing duplicates using Venn software, the targets were imported into the DAVID database to explore their functions and pathways. Finally, the pathways were imported into the CTD database to screen for associated diseases, and the corresponding targets of the predicted diseases were collected. The intersection of the targets obtained from the STP and CTD databases was taken. The "herb - component - target - disease" network was constructed and analyzed using Cytoscape software.Results:A total of 14 chemical components in Poncirus trifoliata were screened out (including hesperidin, glucolactone, naringenin, nootkatone, norepinephrine, synephrine, pentadecanoic acid, decanoic acid, etc.). Based on the degree of target correlation, six components were finally confirmed. There were 19 core targets involved. The pathways corresponding to the targets were five. Conclusion: The diseases involved in the pathways were 13. The prediction of the therapeutic potential and mechanism of action of Poncirus trifoliata based on the bio-labeling model is consistent with the literature reports, indicating that the use of bio-labeling to explore the therapeutic potential and mechanism of action of traditional Chinese medicine is feasible, and also provides a certain research basis for the new clinical application of Poncirus trifoliata.

Keywords: Poncirus trifoliata; biomarker model; Ingredients; Targets; disease

枳壳（Poncirus trifoliata)属于芸香科植物酸橙及其栽培变种的干燥未成熟果实,具有行滞消胀，理气宽中的功能,其性微寒、味苦、辛、酸，临床上主要用于胸胁气滞，胃下垂，食积不化，痰饮内停，胀满疼痛，脱肛，子宫脱垂等^[1]。枳壳主产于江西、四川、湖南、重庆等地，始载于《神农本草经》,被列为中品^[2]。据宋以前诸代医学著作中虽有枳壳的药用方法并却并未直接出现“枳实”之称，直到宋代医药著作《开宝本草》中记载“枳壳，生商州川谷。九月十月采，阴干”才正式立枳壳一称^[3]。枳壳的原植物主要有酸橙枳壳、香圆枳壳、绿衣枳壳和玳玳花枳壳等，大都为常绿小乔木或灌木，花期为3-4月，分布于我国江西、四川、湖南、浙江等多个省份，其中以江西和湖南的产品为佳。枳壳是一味中医常用理气药，据报道^[4-7]，枳壳中含有黄酮类（橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、柚皮芸香苷、异柚皮苷、新枸橘苷、陈皮素、柚皮素、川陈皮素、红橘素、去甲川陈皮素、橙黄酮、4’,5,7,8-四甲氧基黄酮、4-0-甲基黄芩素、3-羟基-3’,4’,5,6,7,8-六甲氧基黄酮和5,6-二羟基-7,4’-二甲氧基黄酮，圣草次苷、新圣草次苷）、香豆素类（葡萄内酯、伞形花内酯、异前胡素、泼朗弗林、异米拉素、花椒毒酚 、5-异戊烯氧基线呋喃香豆素、5-氧基线呋喃香豆素、6’,7’-二羟基香柠檬素、佛手酚、水合橙皮内酯、阿魏酸、柠檬苦素、胡萝卜苷棕榈酸酯、胡萝卜苷）、生物碱类（辛弗林、乙酰去甲辛弗林、N-甲基酪胺、去甲肾上腺素，喹诺啉、那可汀、大麦芽碱等）、挥发油类成分（葵酸、柠檬烯、β-月桂烯、顺式-石竹烯、β-蒎烯、石竹烯氧化物、大根叶烯B、a-蒎烯、香叶烯、Y-松油烯、芳樟醇、a-松油醇），具有调节胃肠道、抗菌、 降血脂、抗氧化、抗肿瘤、保肝及治疗乳腺癌等作用^[8-14]。

基于生物标签研究模式近年来已成为中药研究的热门工具，其系统性和整体性特点为复杂中药体系的研究提供了新思路^[15-18]，其基本思想是基于疾病-基因靶点-药物相互作用网络，分析药物对疾病网络的干预与影响，帮助人们更全面地了解疾病病理基础与药物治疗作用。并筛选出了枳壳的化学成分及相关靶点，通过对其生物标签与相关通路分析，从系统层次和生物网络的整体角度出发探究杜仲的治疗潜能及作用机制，为枳壳的临床应用提供一定的依据。为枳壳临床合理用、新药研发等提供了新的依据。

1.方法

1.1枳壳的化学成分筛选与整理

通过知网、TCMSP等数据查阅枳壳化学成分，将查找的枳壳的化学成分中文名称导入Pubchem和Chemicalbook软件下载每个化学成分的2D结构并保存为mol形式。

1.2预测核心靶点

将1.1下载的化学成分的2D结构导入数据库SwissTargetPrediction数据库并预测对应化学成分的基因靶点。选择Probability>0.5为条件，保留Probability>0.5的化学成分相应的靶点。将化学成分涉及的靶点与疾病涉及的靶点利用Venny进行去重。

1.3 GO功能和KEGG通路富集分析

将1.2去重的靶点导入数据库（DAVID）中，以人类为研究对象进行GO功能富集分析与KEGG信号通路富集分析，将错误发现率（FDR）设为小于0.05。其中GO分析包括分子功能（Molecular Function）、细胞组分（Cellular Component）和生物过程（Biological Process）。

1.4 预测疾病

将1.3得到的KEGG通路分别导入疾病数据库（CTD），从而预测通路涉及的疾病。将所有通路获得的疾病进行合并，并筛选出疾病频率次数较多的疾病。

1.5 构建“药味-化学成分-靶点-通路-疾病”网络图

应用cystoscope v3.6.1构建“药味-成分-靶点-通路-疾病”网络图。

2 结果

2.1 枳壳的化学成分筛选与整理

通过查找知网相关文献及TCMSP数据库查找枳壳的化学成分120余个。通过CTD及STP关联靶点涉及化学成分14（见表2-1）最终根据相关条件确定出枳壳化学成分6个。

表2-1 主要化学成分

化学成分	英文名称	化学式	化学结构
十二烷酸	Lauric acid	C12H2402
十五烷酸	Pentadecanoic cacid	C15H30O2
百里香酚	Thymol	C10H14O
癸酸	Decanoic acid	C10H20O2
新橙皮苷	Neohesperidin	C28H34O15
柚皮苷	Naringin	C27H32O14
柚皮素	Naringenin	C15H12O5
陈皮素	Nobiletin	C21H22O8
4’,5,7,8-四甲氧基黄酮	4’,5,7,8, -tetramethoxyflavone	C19H18O6
葡萄内酯	Auraptene	C19H22O3
伞型花内酯	7-Hydroxycoumarin	C9H6O3
辛弗林	ynephrine	C9H13NO2
去甲肾上腺素	Norepinephrine	C8H11NO3
那可汀	Narcotine	C22H23NO7

2.2预测核心靶点

通过STP与CTD数据库共获核心靶点19个。分别为（FABP3、FABP4、FABP5、FABP2、PPARA、NMUR2、ADRA2A、DRD2、ADRA2B、、ADRA2C、ADRA1A、ADRB2、ADRB1、CYP2C9、CYP2C19、MAOA、MAOB、ADRA1B、PPARD）。

2.3 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析

GO的细胞组分、分子功能及生物学过程分析见图2-1、2-1、2-3。KEGG通路富集分析主要涉及5条通路，见图2-4.

图2-1细胞组分气泡图

图2-2分子功能气泡图

图2-3生物学过程气泡图

图2-4 KEGG通路富集分析气泡图

2.4 预测疾病

通过CTD数据库对KEGG通路进行疾病分析，通过相关条件筛选得到得13个疾病见表2-2，分别是：实验性肝硬化、高血压、自闭性疾病、前列腺肿瘤、肥胖症、物质戒断综合征、可卡因相关障碍、乳腺肿瘤、痛觉过敏、心力衰竭、精神分裂症、原发性肝癌、Ⅱ型糖尿病见图2-5。

表2-2 13种疾病频次总数

2.5 构建“药味-化学成分-靶点-通路-疾病”网络图

图2-5 枳壳的“药味-成分-靶点-通路-疾病”网络

3.讨论

鉴于中药化学成分的复杂性，生物标签研究模式可以在很大程度上反映靶点与成分之间的相互作用，可以有效筛选出中药有效涉及的核心靶点与其相关通路，从而可以将多个靶点在整个生物网络进行定位，加速药物靶点的发现和确认。目前有关枳壳新的药理作用机制研究较少，为进一步探究枳壳的治疗潜能及作用机制，通过整理相关文献及TCMSP数据库搜索，筛选枳壳的化学成分。通过STP数据库预测相关靶点。利用DAVID数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析得到相关的通路及靶点，然后使用CTD数据库预测与通路相关的疾病及关联的靶点，并对化成分涉及的靶点与疾病涉及的靶点利用韦恩进行取交筛选与分析；最后利用Cytoscape软件构建“药味－成分－靶点-通路－疾病”网络图，进一步阐述我们预测的枳壳靶点与所预测的疾病之间具有相关性。经过筛选得到的可能性较大的6个化学成分有（葡萄内酯、那可汀、去甲肾上腺素、辛弗林、十五烷酸、癸酸）葡萄内酯是一个环状分子，其分子内含有五个碳原子和一个氧原子。在环的一个位置上连接有一个羟基（-OH），在另一个位置上连接有一个醛基（-CHO）。药理方面的作用研究相对较少。那可汀属于生物碱类化合物。具有与可待因相等的镇咳作用，且无中枢抑制现象，无成瘾性，此外，那可丁还具有抗肿瘤活性，其作用机制是通过与微管蛋白结合，抑制微管的聚合，从而干扰细胞的有丝分裂。去甲肾上腺素属于儿茶酚胺类，其化学结构是β-苯乙胺的衍生物，苯环上第3、4位碳上都有羟基，形成儿茶酚结构。主要通过激动α受体，对α1和α2无选择性，对心脏β1受体作用较弱，主要引起血管平滑肌收缩，使血压升高。辛弗林属于生物碱中的麻黄碱类，分子结构中同时存在酚羟基和氨基。具有促进脂质代谢、升压和强心、收缩支气管、抗抑郁症等生理活性。其作为减肥促进剂的作用机理是刺激β-3肾上腺素受体而发生脂质分解以及随后产生的生热作用。十五烷酸为饱和脂肪酸，其分子结构中含有15个碳原子的直链烷基和一个羧基（-COOH）。主要通过AMPK途径促进脂肪细胞和骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，改善高胰岛素血症，保护胰岛细胞。葵酸为饱和脂肪酸，其分子结构中含有11个碳原子的直链烷基和一个羧基（-COOH）。主要作为脂肪酸的一种，在生物体内参与能量代谢等生理过程。。预测枳壳可能对实验性肝硬化、高血压、自闭性疾病、前列腺肿瘤、肥胖症、物质戒断综合征、可卡因相关障碍、乳腺肿瘤等13个疾病有一定的治疗作用。这些疾病涉及的基因有19个，与之相关联的通路有五条（环磷酸鸟苷-环磷酸鸟苷依赖蛋白激酶信号通路介导、脑组织神经活动配体-受体相互作用通路、血清素能突触、花生四烯酸代谢、过氧化酶体增殖激活受体信号通路）。“药物－活性成分－靶蛋白-通路－疾病”网络图结果显示实验性肝硬化、高血压、前列腺肿瘤三种疾病的发生和转化与五条通路均有涉及，自闭性疾病除了血清素能突触通路没有涉及以外其余四条均有涉及。下面我以枳壳预测治疗潜能：实验性肝硬化疾病展开探讨。

实验性肝硬化也称之为肝硬化，是临床常见慢性进行性肝脏疾病，是由一种或多种病因长期或反复作用造成的炎症性肝脏损害。而生物碱那可汀（Narcotine）具有抗炎作用。图2-1结果显示，枳壳治疗疾病可定位到细胞膜花生四烯酸（AA）是细胞膜脂质含量的主要成分主要由三种酶代谢：环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和细胞色素P450(CYP450)酶，基于这三种代谢途径，花生四烯酸可以转化为多种代谢产物，引发不同的炎症。从枳壳的疾病预测结果来看，在花生四烯酸代谢途径中涉及的基因蛋白有CYP2C9、CYP2C19，主要来源于细胞色素P450酶代谢途径，CYP2是主要的CYP450环氧合酶家族，早期有关CYP2C的研究表明，CYP2C19产生的14,15-环氧二十碳三烯酸在碳14,15位时非常高效^[19]，由CYP450酶产生的羰基碳五烯酸是花生四烯酸的主要代谢产物，有文献揭示了羟基二苯乙烯四烯酸对过氧化酶增殖物激活受体（PPAR）的激活作用，此外，羰基碳五烯酸还可以激活PPARα^[20-23]，提示枳壳可以通过调控花生四烯酸代谢途径中花生四烯酸的主要产物来有效治疗肝硬化。这一结果为我们所预测出的花生四烯酸代谢信号通路（Arachidonic acid metabolism）及过氧化酶体增殖激活受体信号通路（PPAR signaling pathway）涉及的CYP2C9、CYP2C19、PPARA、PPARD等基因靶点提供了说服力。

综上所述，本文基于生物标签模式探索枳壳治疗潜能进行了初步的探索。阐述了这种技术手段挖掘枳壳的潜在药用价值具有一定的可行性，揭示枳壳具有多靶点、多途径参与治疗多种疾病的特点，为研究枳壳的潜在药用价值、治疗作用机制奠定了一定基础。

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