贴敷类医疗器械中17种化学药物识别及含量测定补充检验方法的方法学研究
于雷1，陈远博2
（1吉林省医疗器械检验研究院，吉林 长春 130062；2吉林省延边朝鲜族自治州邮政业安全中心，吉林 延吉 133000）
摘要：目的 优化并验证高效液相色谱质谱联用仪法对贴敷类医疗器械中17种化学药物进行定性、定量分析。方法 贴敷类医疗器械样品经甲醇低温提取后过滤进样，仪器使用高效液相色谱仪配DAD紫外检测器，以保留时间及190nm-400nm的紫外光谱图一致性作为初筛依据，再采用高效液相色谱-串联质谱法，以提取离子峰保留时间和母离子及碎片离子信息一致性作为定性确认依据，最后使用高效液相色谱法进行定量检测。结论 本研究为“贴敷类医疗器械中 17 种化学药物识别及含量测定补充检验方法”提供方法学验证依据，同时为检验检测机构使用Agilent 1260二元泵高效液相色谱仪串联Agilent 6465三重四级杆质谱仪设备提供仪器参数条件，为贴敷类医疗器械产品的质量监管提供技术支持与参考。
关键词：贴敷类医疗器械；非法添加；化学药物
中文分类号：G312
Methodological study on supplementary testing methods for identification and content determination of 17 chemical drugs in adhesive medical devices
Yu Lei1*，Chen Yuanbo2
(1Jilin Instiute for Medical Devices Control ,Jilin Changchun 130062;2 Jilin Yanbian Security Center for Postal Industy Jilin Yanji 133000)
Abstract:Objective opitmize and validate the HPLC-MS/MS method for adhesive medical devices for 17 kinds chemical drugs addition on qualitative and quantitative analysis.Method the sample solution is prepared by extraction of methanol for adhesive medical devices with filter.The initial screening criteria is based one the consistency of retention time and 190nm-400nm spectrogram by using HPLC-DAD detector.Then qualitative confirmation is based on the consistency of ion peak retention time and mother ion with fragment ion information.Finally,quantitative analysis is based on HPLC.Conclusion this study provides methodological validation basis for the supplementary testing methods for identification and content determination of 17 chemical drugs in adhesive medical devices, and provides instrument parameter for inspection and testing institutions to use Agilent 1260 binary pump HPLC with Agilent 6465 MS/MS spectrometer of triple quadrupole equipment. It also provides technical support and reference for the quality supervision of adhesive medical device products.
Key words:adhesive medical devices;illegal additon;chemical drugs
引言
贴敷类医疗器械产品现广泛应用，通常以退热、消肿、止痛、理疗等作为预期用途，目前常见名称如退热贴、磁疗贴、理疗贴、红外贴等，按II类医疗器械进行注册管理。目前的市场当中，有一部分企业为了盈利，不仅在产品中非法添加了中药成分，还非法添加了解热镇痛抗炎药、糖皮质激素等化学药物[1-3]，逃避监管，冲击市场的正常秩序，给消费者的用械安全带来隐患[4]。患者在不知情的情况下使用后，与自身治疗药物合并，造成药物滥用，不但达不到治疗效果，反而有可能引起严重的不良反应[5,6]。国家药监局发布的贴敷类医疗器械中 17 种化学药物识别及含量测定补充检验方法（2022 年第 12 号）（以下简称补充检验方法），给出了具体参考检验条件，但由于补充检验方法中提及的仪器生产厂家品牌型号等原因，其给出的参考参数并非能够完全适用于其他检验检测机构，故本研究以Agilent 1260二元泵高效液相色谱仪（DAD紫外检测器）串联Agilent 6465三重四级杆质谱仪对17种化学药物的定性和定量进行研究，为“补充检验方法”提供方法学验证，同时为检验机构使用的同款品牌设备提供仪器参数条件，旨在为贴敷类医疗器械的市场监督管理提供技术支持与参考[7]。
1 实验部分
1.1仪器与试剂
高效液相色谱仪（Agilent 1260，二元泵，DAD紫外检测器）、三重四级杆质谱仪（Agilent 6465），电子分析天平（梅特勒MS105DV/A），酸度计（827瑞士万通）；乙腈（色谱纯，Fisher Chemical公司；质谱纯，Merck公司），甲醇（色谱纯，Fisher Chemical公司；质谱纯，Merck公司），磷酸（化学纯，天津市津东天正精细化学试剂厂），超纯水，甲酸铵（成都华夏化学试剂公司），纯化水，17种化学药物的对照品信息如表1所示：
表1 17种化学药物对照品信息
Tab.1 standard information for 17 kinds of chemical drugs
化学药物名称
来源
氨基比林
中国食品药品检定研究院
甲氧苄啶
中国食品药品检定研究院
对乙酰氨基酚
中国食品药品检定研究院
泼尼松
中国食品药品检定研究院
氢化可的松
中国食品药品检定研究院
地塞米松
中国食品药品检定研究院
水杨酸甲酯
中国食品药品检定研究院
醋酸泼尼松
中国食品药品检定研究院
醋酸可的松
中国食品药品检定研究院
酮洛芬
中国食品药品检定研究院
萘普生
中国食品药品检定研究院
醋酸地塞米松
中国食品药品检定研究院
保泰松
上海安谱璀世标准技术有限公司
氟比洛芬
上海安谱璀世标准技术有限公司
布洛芬
中国食品药品检定研究院
吲哚美辛
中国食品药品检定研究院
双氯芬酸钠
中国食品药品检定研究院
供试样品为市面正常销售的贴敷类医疗器械产品，共计90批。
1.2对照品溶液的制备
对照品溶液：精密称取17种化学药物对照品各约0.01 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。完成后再从中精密量取0.1 mL，用甲醇稀释并定容至10 mL容量瓶中，混合均匀。
1.3实验方法
1.3.1 供试品溶液的制备
样品1贴，除去不粘层，留取粘层展开，舒展的贴在定量滤纸上，除去粘层未粘黏到的滤纸部分，然后将粘黏滤纸部分剪成约0.5 cm×0.5 cm碎片，放入150 mL烧瓶中，倒入甲醇使其将样品表层完全浸没，水浴加热至70 ℃回流两次，每次回流时间为2小时。将浸提液转移至100 mL容量瓶中，用少量甲醇洗涤样品三次，合并洗涤液至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。取上述溶液经0.2 μm微孔滤膜过滤后，作为待进样供试液，如有必要可进行稀释。
1.3.2仪器条件
1.3.2.1 HPLC-DAD定性初筛及定量分析
液相色谱条件：XBridge BEH Shield RP18色谱柱（2.5 μm，4.6×150 mm）；流动相组成及梯度洗脱程序如表2所示；流速设定值：1.0 mL/min；柱温设定值：35 ℃；样品室温度设定值：10 ℃；检测波长设定值：220 nm，扫描范围设定值：190 nm-400 nm；进样量设定值：10 μL。
表2 HPLC-DAD流动相梯度洗脱程序
Tab.2 HPLC-DAD mobile phase gradient elution program
时间/min
A（pH3.0磷酸水溶液）
B（甲醇：乙腈=1:1）
0
94%
6%
8
45%
55%
20
45%
55%
25
10%
90%
26
10%
90%
26.5
94%
6%
30
94%
6%
1.3.2.2 HPLC-MS/MS定性确认
液相色谱条件：色谱柱为Hypersil Gold（1.9 μm，100×2.1 mm）；流动相的组成和梯度洗脱设定程序如表3所示；流速设定值：0.2 mL/min；柱温设定值：40 ℃；样品室温度设定值：10 ℃；进样量设定值：2 μL。17种药物检测时，仅水杨酸甲酯、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛和双氯芬酸钠为负离子扫描模式，其他药物均为正离子扫描模式，母离子及碎片离子信息见表4。
表3 HPLC-MS/MS流动相梯度洗脱程序
Tab.3 HPLC-MS/MS mobile phase gradient elution program
时间/min
A（10mmol/L乙酸铵水溶液）
B（甲醇）
0
90%
10%
1
90%
10%
7
5%
95%
11
5%
95%
12
90%
10%
15
90%
10%
表4 17种药物母离子及碎片离子信息
Tab.4 mother ion with fragment ion information for 17 kinds of chemical drugs
名称
m/z
碎片离子信息
氨基比林
232.1444
113*,139,187,217
甲氧苄啶
291.1452
123*,201,245,261,275
对乙酰氨基酚
152.0706
65,92,110*,134
泼尼松
359.1853
147*,237,313,341
氢化可的松
363.2176
97,121*,173,267,309,327,345
地塞米松
393.2072
147,237,319,337,355*,373
水杨酸甲酯
151.0390
75,91*,93,119,121
醋酸泼尼松
401.1959
147,237,295*,313,341,383
醋酸可的松
403.2115
101,163 *,325,343,361
酮洛芬
255.1017
105,177,209*
萘普生
231.1017
170,185*
醋酸地塞米松
435.2177
147,237,309,397*,415
保泰松
309.1598
120,146,160 *,211
氟比洛芬
243.0817
199*
布洛芬
205.1223
159*
吲哚美辛
356.0684
111,297,312*
双氯芬酸钠
294.0094
250*
注：1.*为基峰。
2 参数优化
2.1 HPLC-DAD定性初筛及定量分析条件优化
由于以“补充方法”中紫外初筛部分的高效液相参数条件进行测定时，双氯芬酸钠与吲哚美辛的分离度无法达到要求（分离度≥1.5），故需对梯度洗脱程序进行优化。将多次程序优化的参数进行比对，确定优化的方向。通过优化后的响应信息号对比发现，流动相的中断应应降低水相的总量，因此经多次验证最终确定最优梯度洗脱程序如表5所示，可以满足分离度的要求，故以表5梯度洗脱程序作为最终参数条件。
表5 HPLC-DAD优化后流动相梯度洗脱程序
Tab.5 HPLC-DAD mobile phase gradient elution program after optimization
时间/min
A（%）
B（%）
0
94%
6%
8
45%
55%
13
45%
55%
14
40%
60%
20
40%
60%
25
10%
90%
26
10%
90%
26.5
94%
6%
30
94%
6%
2.2 HPLC-MS/MS定性确认条件优化
由于“补充方法”中Themo Q-Eaxctive Focus型高分辨质谱仪列出的质谱参数条件，Agilent 6465质谱仪无法直接使用此参数，故需要对质谱参数条件进行优化。且部分药物碎片离子数量较多，表3中列出的碎片离子无需全部被检出，本研究以尽可能多的选取信号较为明显的碎片离子为目标，进行质谱条件优化，最终确定最优条件为ESI离子源，正负离子切换MRM扫描模式，气体温度设定值：300 ℃，气体流速设定值：7.0 L/min，雾化器设定值：20 psi，鞘气温度设定值：250 ℃，鞘气流速设定值：11.0 L/min，毛细管电压设定值：4000 v，喷嘴电压设定值：1500 v，其中碰撞电压Fragmentor（v）和碰撞能量CE（v）最优结果见表6。
表6 17种药物优化后质谱条件
Tab.4 mass spectrometer parameters for 17 kinds of chemical drugs after optimization
名称
离子对
电压Fragmentor/v
能量CE/v
氨基比林
232.1→113*
98
10
甲氧苄啶
291.2→275
140
25
291.2→261
140
29
291.2→123*
140
41
对乙酰氨基酚
152.1→110*
70
17
152.1→92
70
25
152.1→65
70
33
泼尼松
359.2→341
100
9
359.2→237
100
21
359.2→147*
100
29
氢化可的松
363.2→327
130
14
363.2→121*
130
26
地塞米松
393.2→373
100
5
393.2→355*
100
5
393.2→237
100
21
393.2→147
100
33
水杨酸甲酯
151.0→91*
46
22
醋酸泼尼松
401.2→383
110
5
401.2→341
110
9
401.2→295*
110
13
401.2→237
110
21
401.2→147
110
33
醋酸可的松
403.2→343
115
21
403.2→163*
115
29
酮洛芬
255.1→209*
110
13
255.1→177
110
21
255.1→105
110
25
萘普生
231.1→185*
75
13
231.1→170
75
25
醋酸地塞米松
435.2→415
95
5
435.2→397*
95
5
435.2→237
95
21
保泰松
309.2→160*
135
22
氟比洛芬
243.1→199*
47
1
布洛芬
205.1→159*
80
5
吲哚美辛
356.1→312*
70
5
356.1→297
70
17
双氯芬酸钠
294.0→250*
74
10
注：1.*为基峰。
3 方法学验证
由于本研究中，HPLC-MS/MS方法部分仅用于定性确认，故方法学验证仅涉及专属性考察部分，而所有方法学验证内容均适用于HPLC-DAD定量分析。
3.1专属性考察
取“1.2”项下制备的溶液，按“2.1”优化后的组价色谱条件测定时，空白溶液在对照品溶液出峰保留时间处无信号峰干扰；按“2.2”项下条件进行测定时，空白溶液在对照品溶液的提取离子峰的保留时间不一致，同时空白溶液与对照品溶液碎片离子丰度比液不一致。通过专属性考察可以证明，本研究方法的专属性强。
3.2系统适用性考察
取“1.2项下的对照品溶液的制备”的溶液，按“2.1”项下条件进行测定，相邻峰分离度≥1.5，理论塔板数＞10000，表明方法系统适用性满足要求。
3.3线性关系考察
将质量浓度为2、4、6、8、10、12 mg/L的17种化学药物混合标准溶液，按“2.1”项下的最优色谱条件测定，以峰面积对浓度进行线性回归，表7为线性回归方程，结果显示R2≥0.984，表明方法线性良好。
表7 标准曲线线性方程
Tab.7 Linear equation of standard curve
化学药物名称
线性方程
R2
氨基比林
y=7.557 000x-13.571 250
0.997 750 16
甲氧苄啶
y=36.946 700x-7.303 800
0.999 637 16
对乙酰氨基酚
y=18.051 000x-1.947 000
0.995 143 33
泼尼松
y=11.201 200x-0.131 200
0.996 618 04
氢化可的松
y=11.066 738x-3.693 025
0.995 064 31
地塞米松
y=10.947 475x+7.131 075
0.989 770 77
水杨酸甲酯
y=23.992 325x-3.314 675
0.996 588 90
醋酸泼尼松
y=10.906 000x-4.083 600
0.997 170 53
醋酸可的松
y=12.639 000x+20.113 500
0.998 822 02
酮洛芬
y=29.525 200x+2.648 000
0.992 945 36
萘普生
y=113.767 500x-3.234 000
0.997 120 14
醋酸地塞米松
y=13.059 750x-15.914 250
0.984 303 47
保泰松
y=27.059 250x-11.055 400
0.998 594 32
氟比洛芬
y=19.816 500x-16.401 000
0.994 613 89
布洛芬
y=25.999 875x-18.447 000
0.996 649 91
吲哚美辛
y=43.291 875x-24.844 875
0.996 850 36
双氯芬酸钠
y=43.478 823x-25.396 202
0.999 325 41
3.4准确度考察
取质量浓度为6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L的混合对照品溶液，每个浓度均需进行三次检测，用每次进样的峰面积计算测定浓度，再计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），计算结果见表8，结果数据显示平均回收率为99.0%-100.8%，RSD≤4.3%，结果表明方法准确度良好。
表8 准确度（平均回收率%）和相对标准偏差（RSD%）
Tab.8 accuracy (average recovery rate%) and relative standard deviation (RSD%)
化学药物名称
平均回收率/%
相对标准偏差/RSD%
氨基比林
99.7
3.7
甲氧苄啶
99.9
1.4
对乙酰氨基酚
99.7
2.2
泼尼松
100.1
2.2
氢化可的松
100.8
2.0
地塞米松
100.4
4.1
水杨酸甲酯
100.0
1.6
醋酸泼尼松
99.6
2.3
醋酸可的松
99.0
3.2
酮洛芬
99.8
2.4
萘普生
100.0
1.6
醋酸地塞米松
100.4
4.3
保泰松
99.8
1.8
氟比洛芬
100.0
3.3
布洛芬
99.7
2.3
吲哚美辛
100.4
2.0
双氯芬酸钠
100.8
2.6
3.6精密度考察
取质量浓度为8 mg/L的混合对照品溶液，按“2.1”项下的最优色谱条件进行测定，每个样品均需进行6次检测，用每次进样的峰面积，计算测定浓度，最后再计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），计算结果见表9，结果数据显示平均回收率为96.0%-99.2%，RSD≤5.0%，结果表明方法精密度良好。
表9 精密度（平均回收率%）和相对标准偏差（RSD%）
Tab.9 precision (average recovery rate%) and relative standard deviation (RSD%)
化学药物名称
平均回收率/%
相对标准偏差/RSD%
氨基比林
96.5
2.2
甲氧苄啶
98.0
1.6
对乙酰氨基酚
96.0
2.3
泼尼松
98.7
2.8
氢化可的松
99.2
1.7
地塞米松
96.1
1.6
水杨酸甲酯
97.0
2.1
醋酸泼尼松
95.4
0.9
醋酸可的松
99.2
5.0
酮洛芬
97.8
1.5
萘普生
98.5
1.0
醋酸地塞米松
97.3
3.3
保泰松
97.3
1.7
氟比洛芬
98.1
2.7
布洛芬
98.2
2.6
吲哚美辛
98.4
0.5
双氯芬酸钠
99.0
2.7
3.7阳性样品考察
共90批样品，取每个批次样品1贴，按“1.3.1”规定的要求制备供试品溶液，按“2.1”和“2.2”项下的最后参数条件设置仪器参数，将供试品溶液进样测试，结果显示其中有1个批次当中，进行DAD定性初筛时，供试品溶液的保留时间和紫外扫描图（190nm-400nm）与对照品溶液中双氯芬酸钠表现一致，质谱定性确认时，供试品溶液的离子提取峰和对照品中双氯芬酸钠的母离子与碎片离子质谱峰保留时间及丰度比均一致，最终由高效液相法进行定量分析，检测结果为双氯芬酸钠含量1.3 mg/贴。
4 讨论
面对日益复杂的贴敷类医疗器械产品，质量安全的监管越加重要，检验检测能力亟需高质量发展。部分标准文件当中给出的方法参数，由于仪器厂家品牌型号等多方面的原因，并非能够完全适用于其他检验检测机构，导致检验方法无法快速推广，其具体的仪器参数条件仍需各机构自行优化，这成为广大检验检测人员的巨大障碍。本研究为“补充检验方法”提供方法学验证，同时为检验机构使用的同款品牌设备提供仪器参数条件，为贴敷类医疗器械产品的质量监管提供技术支持与参考。
贴敷类医疗器械中17种化学药物识别及含量测定补充检验方法的方法学研究
于雷1，陈远博2
（1吉林省医疗器械检验研究院，吉林 长春 130062；2吉林省延边朝鲜族自治州邮政业安全中心，吉林 延吉 133000）
摘要：目的 优化并验证高效液相色谱质谱联用仪法对贴敷类医疗器械中17种化学药物进行定性、定量分析。方法 贴敷类医疗器械样品经甲醇低温提取后过滤进样，仪器使用高效液相色谱仪配DAD紫外检测器，以保留时间及190nm-400nm的紫外光谱图一致性作为初筛依据，再采用高效液相色谱-串联质谱法，以提取离子峰保留时间和母离子及碎片离子信息一致性作为定性确认依据，最后使用高效液相色谱法进行定量检测。结论 本研究为“贴敷类医疗器械中 17 种化学药物识别及含量测定补充检验方法”提供方法学验证依据，同时为检验检测机构使用Agilent 1260二元泵高效液相色谱仪串联Agilent 6465三重四级杆质谱仪设备提供仪器参数条件，为贴敷类医疗器械产品的质量监管提供技术支持与参考。
关键词：贴敷类医疗器械；非法添加；化学药物
中文分类号：G312
Methodological study on supplementary testing methods for identification and content determination of 17 chemical drugs in adhesive medical devices
Yu Lei1*，Chen Yuanbo2
(1Jilin Instiute for Medical Devices Control ,Jilin Changchun 130062;2 Jilin Yanbian Security Center for Postal Industy Jilin Yanji 133000)
Abstract:Objective opitmize and validate the HPLC-MS/MS method for adhesive medical devices for 17 kinds chemical drugs addition on qualitative and quantitative analysis.Method the sample solution is prepared by extraction of methanol for adhesive medical devices with filter.The initial screening criteria is based one the consistency of retention time and 190nm-400nm spectrogram by using HPLC-DAD detector.Then qualitative confirmation is based on the consistency of ion peak retention time and mother ion with fragment ion information.Finally,quantitative analysis is based on HPLC.Conclusion this study provides methodological validation basis for the supplementary testing methods for identification and content determination of 17 chemical drugs in adhesive medical devices, and provides instrument parameter for inspection and testing institutions to use Agilent 1260 binary pump HPLC with Agilent 6465 MS/MS spectrometer of triple quadrupole equipment. It also provides technical support and reference for the quality supervision of adhesive medical device products.
Key words:adhesive medical devices;illegal additon;chemical drugs
引言
贴敷类医疗器械产品现广泛应用，通常以退热、消肿、止痛、理疗等作为预期用途，目前常见名称如退热贴、磁疗贴、理疗贴、红外贴等，按II类医疗器械进行注册管理。目前的市场当中，有一部分企业为了盈利，不仅在产品中非法添加了中药成分，还非法添加了解热镇痛抗炎药、糖皮质激素等化学药物[1-3]，逃避监管，冲击市场的正常秩序，给消费者的用械安全带来隐患[4]。患者在不知情的情况下使用后，与自身治疗药物合并，造成药物滥用，不但达不到治疗效果，反而有可能引起严重的不良反应[5,6]。国家药监局发布的贴敷类医疗器械中 17 种化学药物识别及含量测定补充检验方法（2022 年第 12 号）（以下简称补充检验方法），给出了具体参考检验条件，但由于补充检验方法中提及的仪器生产厂家品牌型号等原因，其给出的参考参数并非能够完全适用于其他检验检测机构，故本研究以Agilent 1260二元泵高效液相色谱仪（DAD紫外检测器）串联Agilent 6465三重四级杆质谱仪对17种化学药物的定性和定量进行研究，为“补充检验方法”提供方法学验证，同时为检验机构使用的同款品牌设备提供仪器参数条件，旨在为贴敷类医疗器械的市场监督管理提供技术支持与参考[7]。
1 实验部分
1.1仪器与试剂
高效液相色谱仪（Agilent 1260，二元泵，DAD紫外检测器）、三重四级杆质谱仪（Agilent 6465），电子分析天平（梅特勒MS105DV/A），酸度计（827瑞士万通）；乙腈（色谱纯，Fisher Chemical公司；质谱纯，Merck公司），甲醇（色谱纯，Fisher Chemical公司；质谱纯，Merck公司），磷酸（化学纯，天津市津东天正精细化学试剂厂），超纯水，甲酸铵（成都华夏化学试剂公司），纯化水，17种化学药物的对照品信息如表1所示：
表1 17种化学药物对照品信息
Tab.1 standard information for 17 kinds of chemical drugs
化学药物名称 | 来源 |
氨基比林 | 中国食品药品检定研究院 |
甲氧苄啶 | 中国食品药品检定研究院 |
对乙酰氨基酚 | 中国食品药品检定研究院 |
泼尼松 | 中国食品药品检定研究院 |
氢化可的松 | 中国食品药品检定研究院 |
地塞米松 | 中国食品药品检定研究院 |
水杨酸甲酯 | 中国食品药品检定研究院 |
醋酸泼尼松 | 中国食品药品检定研究院 |
醋酸可的松 | 中国食品药品检定研究院 |
酮洛芬 | 中国食品药品检定研究院 |
萘普生 | 中国食品药品检定研究院 |
醋酸地塞米松 | 中国食品药品检定研究院 |
保泰松 | 上海安谱璀世标准技术有限公司 |
氟比洛芬 | 上海安谱璀世标准技术有限公司 |
布洛芬 | 中国食品药品检定研究院 |
吲哚美辛 | 中国食品药品检定研究院 |
双氯芬酸钠 | 中国食品药品检定研究院 |
供试样品为市面正常销售的贴敷类医疗器械产品，共计90批。
1.2对照品溶液的制备
对照品溶液：精密称取17种化学药物对照品各约0.01 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。完成后再从中精密量取0.1 mL，用甲醇稀释并定容至10 mL容量瓶中，混合均匀。
1.3实验方法
1.3.1 供试品溶液的制备
样品1贴，除去不粘层，留取粘层展开，舒展的贴在定量滤纸上，除去粘层未粘黏到的滤纸部分，然后将粘黏滤纸部分剪成约0.5 cm×0.5 cm碎片，放入150 mL烧瓶中，倒入甲醇使其将样品表层完全浸没，水浴加热至70 ℃回流两次，每次回流时间为2小时。将浸提液转移至100 mL容量瓶中，用少量甲醇洗涤样品三次，合并洗涤液至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。取上述溶液经0.2 μm微孔滤膜过滤后，作为待进样供试液，如有必要可进行稀释。
1.3.2仪器条件
1.3.2.1 HPLC-DAD定性初筛及定量分析
液相色谱条件：XBridge BEH Shield RP18色谱柱（2.5 μm，4.6×150 mm）；流动相组成及梯度洗脱程序如表2所示；流速设定值：1.0 mL/min；柱温设定值：35 ℃；样品室温度设定值：10 ℃；检测波长设定值：220 nm，扫描范围设定值：190 nm-400 nm；进样量设定值：10 μL。
表2 HPLC-DAD流动相梯度洗脱程序
Tab.2 HPLC-DAD mobile phase gradient elution program
时间/min | A（pH3.0磷酸水溶液） | B（甲醇：乙腈=1:1） |
0 | 94% | 6% |
8 | 45% | 55% |
20 | 45% | 55% |
25 | 10% | 90% |
26 | 10% | 90% |
26.5 | 94% | 6% |
30 | 94% | 6% |
1.3.2.2 HPLC-MS/MS定性确认
液相色谱条件：色谱柱为Hypersil Gold（1.9 μm，100×2.1 mm）；流动相的组成和梯度洗脱设定程序如表3所示；流速设定值：0.2 mL/min；柱温设定值：40 ℃；样品室温度设定值：10 ℃；进样量设定值：2 μL。17种药物检测时，仅水杨酸甲酯、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛和双氯芬酸钠为负离子扫描模式，其他药物均为正离子扫描模式，母离子及碎片离子信息见表4。
表3 HPLC-MS/MS流动相梯度洗脱程序
Tab.3 HPLC-MS/MS mobile phase gradient elution program
时间/min | A（10mmol/L乙酸铵水溶液） | B（甲醇） |
0 | 90% | 10% |
1 | 90% | 10% |
7 | 5% | 95% |
11 | 5% | 95% |
12 | 90% | 10% |
15 | 90% | 10% |
表4 17种药物母离子及碎片离子信息
Tab.4 mother ion with fragment ion information for 17 kinds of chemical drugs
名称 | m/z | 碎片离子信息 |
氨基比林 | 232.1444 | 113*,139,187,217 |
甲氧苄啶 | 291.1452 | 123*,201,245,261,275 |
对乙酰氨基酚 | 152.0706 | 65,92,110*,134 |
泼尼松 | 359.1853 | 147*,237,313,341 |
氢化可的松 | 363.2176 | 97,121*,173,267,309,327,345 |
地塞米松 | 393.2072 | 147,237,319,337,355*,373 |
水杨酸甲酯 | 151.0390 | 75,91*,93,119,121 |
醋酸泼尼松 | 401.1959 | 147,237,295*,313,341,383 |
醋酸可的松 | 403.2115 | 101,163 *,325,343,361 |
酮洛芬 | 255.1017 | 105,177,209* |
萘普生 | 231.1017 | 170,185* |
醋酸地塞米松 | 435.2177 | 147,237,309,397*,415 |
保泰松 | 309.1598 | 120,146,160 *,211 |
氟比洛芬 | 243.0817 | 199* |
布洛芬 | 205.1223 | 159* |
吲哚美辛 | 356.0684 | 111,297,312* |
双氯芬酸钠 | 294.0094 | 250* |
注：1.*为基峰。
2 参数优化
2.1 HPLC-DAD定性初筛及定量分析条件优化
由于以“补充方法”中紫外初筛部分的高效液相参数条件进行测定时，双氯芬酸钠与吲哚美辛的分离度无法达到要求（分离度≥1.5），故需对梯度洗脱程序进行优化。将多次程序优化的参数进行比对，确定优化的方向。通过优化后的响应信息号对比发现，流动相的中断应应降低水相的总量，因此经多次验证最终确定最优梯度洗脱程序如表5所示，可以满足分离度的要求，故以表5梯度洗脱程序作为最终参数条件。
表5 HPLC-DAD优化后流动相梯度洗脱程序
Tab.5 HPLC-DAD mobile phase gradient elution program after optimization
时间/min | A（%） | B（%） |
0 | 94% | 6% |
8 | 45% | 55% |
13 | 45% | 55% |
14 | 40% | 60% |
20 | 40% | 60% |
25 | 10% | 90% |
26 | 10% | 90% |
26.5 | 94% | 6% |
30 | 94% | 6% |
2.2 HPLC-MS/MS定性确认条件优化
由于“补充方法”中Themo Q-Eaxctive Focus型高分辨质谱仪列出的质谱参数条件，Agilent 6465质谱仪无法直接使用此参数，故需要对质谱参数条件进行优化。且部分药物碎片离子数量较多，表3中列出的碎片离子无需全部被检出，本研究以尽可能多的选取信号较为明显的碎片离子为目标，进行质谱条件优化，最终确定最优条件为ESI离子源，正负离子切换MRM扫描模式，气体温度设定值：300 ℃，气体流速设定值：7.0 L/min，雾化器设定值：20 psi，鞘气温度设定值：250 ℃，鞘气流速设定值：11.0 L/min，毛细管电压设定值：4000 v，喷嘴电压设定值：1500 v，其中碰撞电压Fragmentor（v）和碰撞能量CE（v）最优结果见表6。
表6 17种药物优化后质谱条件
Tab.4 mass spectrometer parameters for 17 kinds of chemical drugs after optimization
名称 | 离子对 | 电压Fragmentor/v | 能量CE/v |
氨基比林 | 232.1→113* | 98 | 10 |
甲氧苄啶 | 291.2→275 | 140 | 25 |
291.2→261 | 140 | 29 | |
291.2→123* | 140 | 41 | |
对乙酰氨基酚 | 152.1→110* | 70 | 17 |
152.1→92 | 70 | 25 | |
152.1→65 | 70 | 33 | |
泼尼松 | 359.2→341 | 100 | 9 |
359.2→237 | 100 | 21 | |
359.2→147* | 100 | 29 | |
氢化可的松 | 363.2→327 | 130 | 14 |
363.2→121* | 130 | 26 | |
地塞米松 | 393.2→373 | 100 | 5 |
393.2→355* | 100 | 5 | |
393.2→237 | 100 | 21 | |
393.2→147 | 100 | 33 | |
水杨酸甲酯 | 151.0→91* | 46 | 22 |
醋酸泼尼松 | 401.2→383 | 110 | 5 |
401.2→341 | 110 | 9 | |
401.2→295* | 110 | 13 | |
401.2→237 | 110 | 21 | |
401.2→147 | 110 | 33 | |
醋酸可的松 | 403.2→343 | 115 | 21 |
403.2→163* | 115 | 29 | |
酮洛芬 | 255.1→209* | 110 | 13 |
255.1→177 | 110 | 21 | |
255.1→105 | 110 | 25 | |
萘普生 | 231.1→185* | 75 | 13 |
231.1→170 | 75 | 25 | |
醋酸地塞米松 | 435.2→415 | 95 | 5 |
435.2→397* | 95 | 5 | |
435.2→237 | 95 | 21 | |
保泰松 | 309.2→160* | 135 | 22 |
氟比洛芬 | 243.1→199* | 47 | 1 |
布洛芬 | 205.1→159* | 80 | 5 |
吲哚美辛 | 356.1→312* | 70 | 5 |
356.1→297 | 70 | 17 | |
双氯芬酸钠 | 294.0→250* | 74 | 10 |
注：1.*为基峰。
3 方法学验证
由于本研究中，HPLC-MS/MS方法部分仅用于定性确认，故方法学验证仅涉及专属性考察部分，而所有方法学验证内容均适用于HPLC-DAD定量分析。
3.1专属性考察
取“1.2”项下制备的溶液，按“2.1”优化后的组价色谱条件测定时，空白溶液在对照品溶液出峰保留时间处无信号峰干扰；按“2.2”项下条件进行测定时，空白溶液在对照品溶液的提取离子峰的保留时间不一致，同时空白溶液与对照品溶液碎片离子丰度比液不一致。通过专属性考察可以证明，本研究方法的专属性强。
3.2系统适用性考察
取“1.2项下的对照品溶液的制备”的溶液，按“2.1”项下条件进行测定，相邻峰分离度≥1.5，理论塔板数＞10000，表明方法系统适用性满足要求。
3.3线性关系考察
将质量浓度为2、4、6、8、10、12 mg/L的17种化学药物混合标准溶液，按“2.1”项下的最优色谱条件测定，以峰面积对浓度进行线性回归，表7为线性回归方程，结果显示R2≥0.984，表明方法线性良好。
表7 标准曲线线性方程
Tab.7 Linear equation of standard curve
化学药物名称 | 线性方程 | R2 |
氨基比林 | y=7.557 000x-13.571 250 | 0.997 750 16 |
甲氧苄啶 | y=36.946 700x-7.303 800 | 0.999 637 16 |
对乙酰氨基酚 | y=18.051 000x-1.947 000 | 0.995 143 33 |
泼尼松 | y=11.201 200x-0.131 200 | 0.996 618 04 |
氢化可的松 | y=11.066 738x-3.693 025 | 0.995 064 31 |
地塞米松 | y=10.947 475x+7.131 075 | 0.989 770 77 |
水杨酸甲酯 | y=23.992 325x-3.314 675 | 0.996 588 90 |
醋酸泼尼松 | y=10.906 000x-4.083 600 | 0.997 170 53 |
醋酸可的松 | y=12.639 000x+20.113 500 | 0.998 822 02 |
酮洛芬 | y=29.525 200x+2.648 000 | 0.992 945 36 |
萘普生 | y=113.767 500x-3.234 000 | 0.997 120 14 |
醋酸地塞米松 | y=13.059 750x-15.914 250 | 0.984 303 47 |
保泰松 | y=27.059 250x-11.055 400 | 0.998 594 32 |
氟比洛芬 | y=19.816 500x-16.401 000 | 0.994 613 89 |
布洛芬 | y=25.999 875x-18.447 000 | 0.996 649 91 |
吲哚美辛 | y=43.291 875x-24.844 875 | 0.996 850 36 |
双氯芬酸钠 | y=43.478 823x-25.396 202 | 0.999 325 41 |
3.4准确度考察
取质量浓度为6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L的混合对照品溶液，每个浓度均需进行三次检测，用每次进样的峰面积计算测定浓度，再计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），计算结果见表8，结果数据显示平均回收率为99.0%-100.8%，RSD≤4.3%，结果表明方法准确度良好。
表8 准确度（平均回收率%）和相对标准偏差（RSD%）
Tab.8 accuracy (average recovery rate%) and relative standard deviation (RSD%)
化学药物名称 | 平均回收率/% | 相对标准偏差/RSD% |
氨基比林 | 99.7 | 3.7 |
甲氧苄啶 | 99.9 | 1.4 |
对乙酰氨基酚 | 99.7 | 2.2 |
泼尼松 | 100.1 | 2.2 |
氢化可的松 | 100.8 | 2.0 |
地塞米松 | 100.4 | 4.1 |
水杨酸甲酯 | 100.0 | 1.6 |
醋酸泼尼松 | 99.6 | 2.3 |
醋酸可的松 | 99.0 | 3.2 |
酮洛芬 | 99.8 | 2.4 |
萘普生 | 100.0 | 1.6 |
醋酸地塞米松 | 100.4 | 4.3 |
保泰松 | 99.8 | 1.8 |
氟比洛芬 | 100.0 | 3.3 |
布洛芬 | 99.7 | 2.3 |
吲哚美辛 | 100.4 | 2.0 |
双氯芬酸钠 | 100.8 | 2.6 |
3.6精密度考察
取质量浓度为8 mg/L的混合对照品溶液，按“2.1”项下的最优色谱条件进行测定，每个样品均需进行6次检测，用每次进样的峰面积，计算测定浓度，最后再计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），计算结果见表9，结果数据显示平均回收率为96.0%-99.2%，RSD≤5.0%，结果表明方法精密度良好。
表9 精密度（平均回收率%）和相对标准偏差（RSD%）
Tab.9 precision (average recovery rate%) and relative standard deviation (RSD%)
化学药物名称 | 平均回收率/% | 相对标准偏差/RSD% |
氨基比林 | 96.5 | 2.2 |
甲氧苄啶 | 98.0 | 1.6 |
对乙酰氨基酚 | 96.0 | 2.3 |
泼尼松 | 98.7 | 2.8 |
氢化可的松 | 99.2 | 1.7 |
地塞米松 | 96.1 | 1.6 |
水杨酸甲酯 | 97.0 | 2.1 |
醋酸泼尼松 | 95.4 | 0.9 |
醋酸可的松 | 99.2 | 5.0 |
酮洛芬 | 97.8 | 1.5 |
萘普生 | 98.5 | 1.0 |
醋酸地塞米松 | 97.3 | 3.3 |
保泰松 | 97.3 | 1.7 |
氟比洛芬 | 98.1 | 2.7 |
布洛芬 | 98.2 | 2.6 |
吲哚美辛 | 98.4 | 0.5 |
双氯芬酸钠 | 99.0 | 2.7 |
3.7阳性样品考察
共90批样品，取每个批次样品1贴，按“1.3.1”规定的要求制备供试品溶液，按“2.1”和“2.2”项下的最后参数条件设置仪器参数，将供试品溶液进样测试，结果显示其中有1个批次当中，进行DAD定性初筛时，供试品溶液的保留时间和紫外扫描图（190nm-400nm）与对照品溶液中双氯芬酸钠表现一致，质谱定性确认时，供试品溶液的离子提取峰和对照品中双氯芬酸钠的母离子与碎片离子质谱峰保留时间及丰度比均一致，最终由高效液相法进行定量分析，检测结果为双氯芬酸钠含量1.3 mg/贴。
4 讨论
面对日益复杂的贴敷类医疗器械产品，质量安全的监管越加重要，检验检测能力亟需高质量发展。部分标准文件当中给出的方法参数，由于仪器厂家品牌型号等多方面的原因，并非能够完全适用于其他检验检测机构，导致检验方法无法快速推广，其具体的仪器参数条件仍需各机构自行优化，这成为广大检验检测人员的巨大障碍。本研究为“补充检验方法”提供方法学验证，同时为检验机构使用的同款品牌设备提供仪器参数条件，为贴敷类医疗器械产品的质量监管提供技术支持与参考。
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2024.05.011.
作者简介：于雷（1988—），男，满族，吉林省吉林市人，硕士学历，工程师，从事工作为医疗器械检验。
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