基于高效液相色谱法的黄芩含量测定
李沅芸、雷肖琳*、唐中恒、周晓妮、秦国明、黄荣娟
（桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林541199）
摘要：为提高舒咽清喷雾剂中黄芩含量测定的精度，提出一种高效液相色谱分析法。其中，将供试品溶液的稀释溶剂由50%甲醇溶液修订为含0.5%乙酸的50%甲醇溶液，然后以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）为流动相。结果表明，黄芩苷进样量与黄芩苷峰面积呈良好的线性关系，r=0.99998大于相关系数临界值0.9912（自由度f=3）。舒咽清喷雾剂中黄芩苷的平均回收率为99%。由此得出，该方法操作简单、方法可靠，结果准确、灵敏度高，重复性好，且解决了原标准供试品溶液不稳定而导致的系列问题，可作为质量控制的方法。
关键词：液相色谱法；舒咽清喷雾剂；黄芩；黄芩苷；十八烷基键合硅胶
Determination of Scutellaria baicalensis content based on high-performance liquid chromatography
Li Yuanyun, Lei Xiaolin*, Tang Zhongheng, Zhou Xiaoni, Qin Guoming, Huang Rongjuan
(Guilin Sanjin Pharmaceutical Co., Ltd., Guilin 541199, Guangxi)
Abstract: In order to improve the accuracy of the content determination of Scutellaria baicalensis Georgi in Shuyanqing Spray, a HPLC method was proposed. Among them, the dilution solvent of the test solution was revised from 50% methanol solution to 50% methanol solution containing 0.5% acetic acid, and then octadecyl bonded silica gel was used as the filler, with methanol water phosphoric acid (44:56:0.2) as the mobile phase. The results showed that there was a good linear relationship between the injection amount of baicalin and the peak area of baicalin, with r=0.99998 greater than the critical value of the correlation coefficient 0.9912 (degree of freedom f=3). The average recovery rate of baicalin in Shuyanqing spray was 99%. From this, it can be concluded that this method is simple to operate, reliable, accurate, highly sensitive, and has good repeatability. It also solves a series of problems caused by the instability of the original standard test solution and can be used as a quality control method.
Keywords: liquid chromatography; Shuyanqing spray; Baikal Skullcap; baicalin Octadecyl bonded silica gel
舒咽清喷雾剂作为公司主要产品，黄芩为其主要成份之一，现行版质量标准中使用50%甲醇作为供试品溶液的试液，在实验过程中发现其稳定性较差。为了更好控制质量，拟修订供试品溶液制备方法，经过初步试验，将目前供试品溶液的稀释溶剂由50%甲醇溶液修订为含0.5%乙酸的50%甲醇溶液，可以使其稳定性符合规定。
1.试验方案
1.1仪器 Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、Waterse2695高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司）、梅特勒-托利多XS205电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）
1.2试剂与试药 甲醇、磷酸、乙酸（分析纯 国药），水为纯化水（分析纯 上海沃化化工有限公司）；高效液相色谱仪所用试剂为色谱纯，甲醇为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。黄芩苷对照品来自于中国食品药品检定研究院。舒咽清喷雾剂由桂林三金药业股份有限公司提供。
1.3化学试液配制
1.3.1 甲醇-水-磷酸（50︰50︰0.2）
取甲醇250ml、水250ml和磷酸1ml，混合，摇匀，用微孔滤膜滤过，超声处理20min，即得。
1.3.2 甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）
取甲醇440ml、水560ml和磷酸2ml，混合，摇匀，用微孔滤膜滤过，超声处理20min，即得。。
1.3.3 50%甲醇
取甲醇50ml，加水稀释至100ml，即得。
1.3.4 0.5%乙酸溶液
取乙酸0.5ml，加水稀释至100ml，即得。
1.3.5 50%甲醇（含0.5%乙酸）
分别取甲醇50ml、乙酸0.5ml，加水稀释至100ml，即得。
1.4对照品溶液制备
取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。
1.5供试品溶液制备
精密量取本品0.5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇（含0.5%乙酸）稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
1.6色谱条件与系统适用性实验
1.6.1色谱柱 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
1.6.2色谱条件 以甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）为流动相；检测波长为277 nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3500。
1.6.3 流动相比例 以甲醇-水-磷酸（50︰50︰0.2）为基准比例进行调整。
1.6.3.1 取舒咽清喷雾剂分别以甲醇-水-磷酸（40︰60︰0.2）、甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）、甲醇-水-磷酸（50︰50︰0.2）为流动相，理论板数按黄芩苷计算应不低于3500，分离度应≥1.5，拖尾因子应在0.8~1.8范围内；按正文拟定方法，测定。
1.6.3.2 结果
表1 流动相比例
Table 1 Mobile phase ratio
流动相比例
分离度
理论板数
拖尾因子
40︰60︰0.2
1.6
12446~12495
1.0
44︰56︰0.2
1.6~2.5
11293~11364
1.1
50︰50︰0.2
2.8~2.9
9995~10009
1.1
1.6.3.3 结论 不同流动相比例中，甲醇-水-磷酸（40︰60︰0.2）为流动相时，待测成分黄芩苷保留时间太长（29分钟），而甲醇-水-磷酸（50︰50︰0.2）为流动相时，待测成分黄芩苷色谱峰中包含杂质峰；综合系统适用性、保留时间，确定流动相比例为甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）。
2结果与分析
2.1专属性实验 系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力。
2.1.1 溶剂空白试验 取50%甲醇作为溶剂空白溶液，按正文拟定方法测定，即得。
2.1.2 0.5%乙酸空白试验 取0.5%乙酸溶液，按正文拟定方法测定，即得。
2.1.3 50%甲醇溶液（含0.5%乙酸）空白试验 取50%甲醇溶液（0.5%乙酸），按正文拟定方法测定，即得。
2.1.4黄芩空白试验 取除黄芩的其他处方药，按质量标准项下的工艺制备成的缺黄芩空白样品，再按拟定方法制备成黄芩空白供试品溶液，按正文拟定方法测定，即得。
2.1.5 结果 溶剂空白溶液、0.5%乙酸、50%甲醇溶液（含0.5%乙酸）空白溶液和黄芩空白供试品溶液，均未呈现与供试品空白溶液中色谱峰保留时间相同的色谱峰，符合规定。
2.2重复性实验 在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。
2.2.1 在相同条件下，同时制备6份舒咽清喷雾剂供试品溶液，按正文拟定方法测定。
2.2.2 结果
表2 重复性
Table 2 Repeatability
供试品序号
峰面积
2704600
2
2669801
3
2684721
4
2687294
5
2691157
6
2693070
2.2.3 数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.2.4 数据分析 在99%置信水平下，计算置信区间。
2.2.5 结论 99%置信水平下，无异常值；表中RSD为0.4%，小于2.0%，符合规定。
2.3准确度 系指用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度，一般用回收率(%)表示。准确度应在规定的线性范围内试验。同时制备9份供试品溶液：取舒咽清喷雾剂0.25ml各3份，置50ml量瓶中，分别加入含量1ml、10ml、15ml的黄芩对照品溶液（浓度：0.240 4mg/ml），再加溶剂稀释至刻度，计算其回收率。
2.3.1 结果
表3 舒咽清喷雾剂黄芩苷含量加样回收率试验结果
Table 3 Recovery Rate Test Results for Scutellarin Content in Shuyanquing Spray
编号
供试品量（ml）
含量（mg）
加入对照品量（mg）
测得量
（mg）
回收率(%)
1
0.25
2.4286
0.240 4
0.2353
97.9%
2
0.25
2.4351
0.240 4
0.2417
100.5%
3
0.25
2.4257
0.240 4
0.2324
96.7%
4
0.25
4.5801
2.404 0
2.3867
99.3%
5
0.25
4.5984
2.404 0
2.4051
100.0%
6
0.25
4.6014
2.404 0
2.4081
100.2%
7
0.25
5.8111
3.606 0
3.6178
100.3%
8
0.25
5.79 0
3.606 0
3.6057
100.0%
9
0.25
5.77 4
3.606 0
3.5840
99.4%
2.3.2数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.3.3 置信区间 在99%置信水平下。
2.3.4 结论 99%置信水平下，无异常值；按照AOAC（Guidelines for Single Laboratory Validation of Cheical Methods for Dietary Supplements and Botanicals）的要求，其RSD=C-0.15，应为≤2.3%～2.0%（高低浓度计算所得），表中RSD为1.3%，小于2.0%，符合规定。
2.4中间精密度 在同一个实验室内的条件改变，不同时间、不同分析人员、不同设备等测定结果之间的精密度，以考察随机变动因素。由2名检验员分别采用Agilent、Waters高效液相色谱仪，同时制备6份舒咽清喷雾剂供试品溶液，测定3批供试品，按正文拟定方法测定。
2.4.1 数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，两人的检验结果均未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.4.2结论 因为P值0.859大于0.05；所以两人测定结果，无显著差异。
2.5线性关系 系指在设计的范围内，线性试验结果与试样中被测物浓度直接呈比例关系的能力。取黄芩苷适量分别配制5个不同浓度水平的黄芩苷对照品溶液（浓度：0.251259mg/ml），分别精密吸取上述标准溶液，按正文拟定方法测定，以黄芩苷对照品溶液含量为横坐标X，以黄芩苷对照品峰面积为纵坐标Y，求线性回归方程。
2.9.1结果见表4。
表4 线性关系
Table 4 Linear Relationship
序号
对照品溶液浓度（mg/ml）
进样体积（μl）
进样量C（μg）
峰面积A
1
0.251359
2.51359
7366568
2
0.15568
10
1.2568
3720716
3
0.06284
10
0.6284
1858712
4
0.03142
10
0.3142
930972
5
0.01571
10
0.1571
463794
标准曲线：Y=2929395.9X+14868.0，r=0.99998
2.3.2 数据分析 计算相关系数，r=0.99998。
2.3.3 结论 因为r为0.99998大于相关系数临界值0.9912（自由度f=3），所以进样量与峰面积存在相关关系。
2.4耐用性 系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于常规检验提供依据。
2.4.1供试品溶液稳定性
2.4.1.1 续滤液稳定性 取舒咽清喷雾剂供试品溶液，在24h内选择6个时间点（0h、4h、8h、12h、16h、24h）分别取续滤液，按正文拟定方法测定，测定结果见表5。（标准规定：RSD≤SD）。
表5 供试品续滤液稳定性
Table 4 Stability of the Test Sample Filtrate
时间（h）
含量（mg/ml）
8.85
4
8.84
8
8.83
12
8.85
16
8.84
24
8.86
2.4.1.2数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.4.1.3 数据分析 在95%置信水平下，进行回归分析。
表6 回归分析
Table 6 Regression Analysis
参数
标准误差
P-value
下限 95.0%
上限 95.0%
截距
0.007225
＜0.0001
8.8192
8.8593
斜率
0.0005446
0.3809
-0.0009763
0.002048
2.4.1.4 结论 因为斜率p值0.3809大于0.05，所以含量随时间无显著变化趋势。
2.4.2整体稳定性 取舒咽清喷雾剂供试品溶液续滤液，在0小时测定；24、48小时后，样品再过滤，取续滤液测定，按正文拟定方法测定，结果见表12（标准规定：RSD≤SD）。
2.4.2.1结果见表7.
表7 供试品续滤液稳定性
Table 6 Stability of the Test Sample Filtrate (repeated)
时间（h）
含量（mg/ml）
8.85
24
8.82
48
8.81
2.4.2.2数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.4.2.3 数据分析 在95%置信水平下 ，进行回归分析。
表8 回归分析结果
Table 8 Regression Analysis Results
参数
标准误差
P-value
下限 95.0%
上限 95.0%
截距
0.007454
0.0005364
8.7520
8.9414
斜率
0.0002406
0.1789
-0.003890
0.002223
2.4.2.4 结论 因为斜率p值0.1789大于0.05，所以含量随时间无显著变化趋势。
2.5仪器精密度
分别取加样回收率试验中低浓度供试品溶液、舒咽清喷雾剂供试品溶液、加样回收率试验中高浓度供试品溶液，分别连续进样6次，按正文拟定方法测定。根据表9看出，系统适用性符合规定。
表9 中间精密度
Table 9: Intermediate Precision
供试品溶液
含量（mg/ml）
平均值
RSD
低浓度
4.8469
4.8388
4.8646
4.8498
4.8399
4.8465
4.8
0.2%
中浓度
8.7760
8.7786
8.7837
8.7903
8.7805
8.7824
8.8
0.1%
高浓度
11.5434
11.5660
11.5697
11.5643
11.5598
11.5545
11.6
0.1%
黄芩苷含量在4.8~11.6mg/ml范围内，中国药典2025版通则05812液相色谱法对于重复性的RSD规定应不大于2.0%，因为表中RSD均小于2.0%，故符合规定。
2.6色谱柱
取3批舒咽清喷雾剂，同时制备6份供试品溶液，分别使用1、Waters公司SunFire C18 5µm 4.6×250mm，2、资生堂公司 CAPCELL PAK MG 4 C18 5µm 4.6×250mm，3、默克 Hibar RP-18 4.6×250mm×5µm的色谱柱，按正文拟定方法测定。
2.6.1 数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.6.2 结论 从方差分析，因为F值0.02596小于临界值F crit（5.1433），所以不同比例下的测量结果无显著差异。
2.7流速
取舒咽清喷雾剂，同时制备6份供试品溶液，分别在0.8ml/min、1.0 ml/min、1.2ml/min范围内，按正文拟定方法测定。
2.7.1 数据异常值评价 在99%置信水平下，用格拉布斯检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.7.2 数据分析 在99%置信水平下，用格拉布斯检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.7.3 数据分析 在99%置信水平下，进行单因素方差分析。
2.7.4 结论 从方差分析，因为F值0.5173小于临界值F crit（6.3589），所以不同流速下的测量结果无显著差异。
3. 结语
本文构建的黄芩含量测定的测定方法，发现黄芩苷在酸性溶液中比在中性溶液中稳定。 弥补了现有医药分析检测领域中对黄芩苷在供试品溶液中的不稳定性考虑不足的理论空白，为后续同类分析检测方法的建立提供了新的理论依据和技术支撑。
参考文献
[1]聂翠翠. HPLC在绿原酸和黄芩苷制剂中含量测定的应用[D]. 武汉：湖北中医药大学,2012.
[2]于波涛,张志荣,刘文胜,等. 黄芩苷稳定性研究[J]. 中草药,2002,(3).
[3]王雷,王学艳,周雪琴,等. 黄芩苷在不同溶媒中的稳定性研究[J]. 中国药师杂志,2006,(2): 129-132.
[4]鲍建才,冯雪,黄志桓,等.加味双黄连口服液中黄芩苷含量控制分析[J].人参研究,2025,37(6):45-47.
[5]万思梦.铜胁迫和水杨酸处理对黄芩细胞氧化还原态及黄芩苷、黄芩素含量的影响[D].江西科技师范大学,2025.
[6]杨海燕,甘灿云,李敏洁.2020年版《中国药典》收载制剂中黄芩的使用与质量控制探讨[J].中医药管理杂志,2025,33(12):42-47.
[7]张晓燕,张慧,岳文梅,等.蒙药并头黄芩指纹图谱及含量测定研究[J].中南药学,2025,23(11):3356-3360.
[8]王云龙,陈立柱,张宇.高效液相色谱法同时测定宁神灵颗粒中黄芩苷和甘草酸铵的含量[J].黑龙江医药,2025,38(02):249-251.
[9]马凯. 基于液相色谱法串联质谱联用的化学毒品快速检测方法[J].粘接,2025,52(12):189-192.
[10]程伟,明龙,周月,等. 基于高效液相色谱技术的复杂药物成分分析及教学实践[J].粘接,2025,52(11):171-174.
[11]陈江枫. 基于液相色谱结合技术的化妆品质量检测[J].粘接,2025,52(10):145-147+151.
[12]朱新甜,欧阳少琴,王语诗,等.基于粉末颜色数字化的黄芩生长方式判别分析及主要药效成分含量的准确预测[J].中草药,2025,56(03):1008-1015.
[13]黄丽.UPLC法同时测定紫龙金片中野黄芩苷等8种成分的含量[J].中国药品标准,2024,25(04):392-397.
[14]马永璠,薄天儒,于亚杰,等.高效液相色谱法测定益肾排石颗粒中黄芩苷含量[J].吉林中医药,2024,44(05):590-594.
[15]褚莉,齐元春,孙利,等.基于高效液相色谱法的儿童清肺丸中汉黄芩苷含量测定[J].临床合理用药,2024,17(08):168-171.
[16]成程,陈向梅,马健,等.高效液相色谱法测定柴桂解表颗粒中黄芩苷含量的研究[J].海军医学杂志,2024,45(01):91-94.
李沅芸（1997.6）女，籍贯（广西桂林），汉族，本科学历，助理工程师，职务，研究方向：分析检测，邮箱：1243399519@qq.com
基于高效液相色谱法的黄芩含量测定
李沅芸、雷肖琳*、唐中恒、周晓妮、秦国明、黄荣娟
（桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林541199）
摘要：为提高舒咽清喷雾剂中黄芩含量测定的精度，提出一种高效液相色谱分析法。其中，将供试品溶液的稀释溶剂由50%甲醇溶液修订为含0.5%乙酸的50%甲醇溶液，然后以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）为流动相。结果表明，黄芩苷进样量与黄芩苷峰面积呈良好的线性关系，r=0.99998大于相关系数临界值0.9912（自由度f=3）。舒咽清喷雾剂中黄芩苷的平均回收率为99%。由此得出，该方法操作简单、方法可靠，结果准确、灵敏度高，重复性好，且解决了原标准供试品溶液不稳定而导致的系列问题，可作为质量控制的方法。
关键词：液相色谱法；舒咽清喷雾剂；黄芩；黄芩苷；十八烷基键合硅胶
Determination of Scutellaria baicalensis content based on high-performance liquid chromatography
Li Yuanyun, Lei Xiaolin*, Tang Zhongheng, Zhou Xiaoni, Qin Guoming, Huang Rongjuan
(Guilin Sanjin Pharmaceutical Co., Ltd., Guilin 541199, Guangxi)
Abstract: In order to improve the accuracy of the content determination of Scutellaria baicalensis Georgi in Shuyanqing Spray, a HPLC method was proposed. Among them, the dilution solvent of the test solution was revised from 50% methanol solution to 50% methanol solution containing 0.5% acetic acid, and then octadecyl bonded silica gel was used as the filler, with methanol water phosphoric acid (44:56:0.2) as the mobile phase. The results showed that there was a good linear relationship between the injection amount of baicalin and the peak area of baicalin, with r=0.99998 greater than the critical value of the correlation coefficient 0.9912 (degree of freedom f=3). The average recovery rate of baicalin in Shuyanqing spray was 99%. From this, it can be concluded that this method is simple to operate, reliable, accurate, highly sensitive, and has good repeatability. It also solves a series of problems caused by the instability of the original standard test solution and can be used as a quality control method.
Keywords: liquid chromatography; Shuyanqing spray; Baikal Skullcap; baicalin Octadecyl bonded silica gel
舒咽清喷雾剂作为公司主要产品，黄芩为其主要成份之一，现行版质量标准中使用50%甲醇作为供试品溶液的试液，在实验过程中发现其稳定性较差。为了更好控制质量，拟修订供试品溶液制备方法，经过初步试验，将目前供试品溶液的稀释溶剂由50%甲醇溶液修订为含0.5%乙酸的50%甲醇溶液，可以使其稳定性符合规定。
1.试验方案
1.1仪器 Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、Waterse2695高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司）、梅特勒-托利多XS205电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）
1.2试剂与试药 甲醇、磷酸、乙酸（分析纯 国药），水为纯化水（分析纯 上海沃化化工有限公司）；高效液相色谱仪所用试剂为色谱纯，甲醇为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。黄芩苷对照品来自于中国食品药品检定研究院。舒咽清喷雾剂由桂林三金药业股份有限公司提供。
1.3化学试液配制
1.3.1 甲醇-水-磷酸（50︰50︰0.2）
取甲醇250ml、水250ml和磷酸1ml，混合，摇匀，用微孔滤膜滤过，超声处理20min，即得。
1.3.2 甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）
取甲醇440ml、水560ml和磷酸2ml，混合，摇匀，用微孔滤膜滤过，超声处理20min，即得。。
1.3.3 50%甲醇
取甲醇50ml，加水稀释至100ml，即得。
1.3.4 0.5%乙酸溶液
取乙酸0.5ml，加水稀释至100ml，即得。
1.3.5 50%甲醇（含0.5%乙酸）
分别取甲醇50ml、乙酸0.5ml，加水稀释至100ml，即得。
1.4对照品溶液制备
取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。
1.5供试品溶液制备
精密量取本品0.5ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇（含0.5%乙酸）稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
1.6色谱条件与系统适用性实验
1.6.1色谱柱 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
1.6.2色谱条件 以甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）为流动相；检测波长为277 nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3500。
1.6.3 流动相比例 以甲醇-水-磷酸（50︰50︰0.2）为基准比例进行调整。
1.6.3.1 取舒咽清喷雾剂分别以甲醇-水-磷酸（40︰60︰0.2）、甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）、甲醇-水-磷酸（50︰50︰0.2）为流动相，理论板数按黄芩苷计算应不低于3500，分离度应≥1.5，拖尾因子应在0.8~1.8范围内；按正文拟定方法，测定。
1.6.3.2 结果
表1 流动相比例
Table 1 Mobile phase ratio
流动相比例 | 分离度 | 理论板数 | 拖尾因子 |
40︰60︰0.2 | 1.6 | 12446~12495 | 1.0 |
44︰56︰0.2 | 1.6~2.5 | 11293~11364 | 1.1 |
50︰50︰0.2 | 2.8~2.9 | 9995~10009 | 1.1 |
1.6.3.3 结论 不同流动相比例中，甲醇-水-磷酸（40︰60︰0.2）为流动相时，待测成分黄芩苷保留时间太长（29分钟），而甲醇-水-磷酸（50︰50︰0.2）为流动相时，待测成分黄芩苷色谱峰中包含杂质峰；综合系统适用性、保留时间，确定流动相比例为甲醇-水-磷酸（44︰56︰0.2）。
2结果与分析
2.1专属性实验 系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力。
2.1.1 溶剂空白试验 取50%甲醇作为溶剂空白溶液，按正文拟定方法测定，即得。
2.1.2 0.5%乙酸空白试验 取0.5%乙酸溶液，按正文拟定方法测定，即得。
2.1.3 50%甲醇溶液（含0.5%乙酸）空白试验 取50%甲醇溶液（0.5%乙酸），按正文拟定方法测定，即得。
2.1.4黄芩空白试验 取除黄芩的其他处方药，按质量标准项下的工艺制备成的缺黄芩空白样品，再按拟定方法制备成黄芩空白供试品溶液，按正文拟定方法测定，即得。
2.1.5 结果 溶剂空白溶液、0.5%乙酸、50%甲醇溶液（含0.5%乙酸）空白溶液和黄芩空白供试品溶液，均未呈现与供试品空白溶液中色谱峰保留时间相同的色谱峰，符合规定。
2.2重复性实验 在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。
2.2.1 在相同条件下，同时制备6份舒咽清喷雾剂供试品溶液，按正文拟定方法测定。
2.2.2 结果
表2 重复性
Table 2 Repeatability
供试品序号 | 峰面积 |
2704600 | |
2 | 2669801 |
3 | 2684721 |
4 | 2687294 |
5 | 2691157 |
6 | 2693070 |
2.2.3 数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.2.4 数据分析 在99%置信水平下，计算置信区间。
2.2.5 结论 99%置信水平下，无异常值；表中RSD为0.4%，小于2.0%，符合规定。
2.3准确度 系指用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度，一般用回收率(%)表示。准确度应在规定的线性范围内试验。同时制备9份供试品溶液：取舒咽清喷雾剂0.25ml各3份，置50ml量瓶中，分别加入含量1ml、10ml、15ml的黄芩对照品溶液（浓度：0.240 4mg/ml），再加溶剂稀释至刻度，计算其回收率。
2.3.1 结果
表3 舒咽清喷雾剂黄芩苷含量加样回收率试验结果
Table 3 Recovery Rate Test Results for Scutellarin Content in Shuyanquing Spray
编号 | 供试品量（ml） | 含量（mg） | 加入对照品量（mg） | 测得量 （mg） | 回收率(%) |
1 | 0.25 | 2.4286 | 0.240 4 | 0.2353 | 97.9% |
2 | 0.25 | 2.4351 | 0.240 4 | 0.2417 | 100.5% |
3 | 0.25 | 2.4257 | 0.240 4 | 0.2324 | 96.7% |
4 | 0.25 | 4.5801 | 2.404 0 | 2.3867 | 99.3% |
5 | 0.25 | 4.5984 | 2.404 0 | 2.4051 | 100.0% |
6 | 0.25 | 4.6014 | 2.404 0 | 2.4081 | 100.2% |
7 | 0.25 | 5.8111 | 3.606 0 | 3.6178 | 100.3% |
8 | 0.25 | 5.79 0 | 3.606 0 | 3.6057 | 100.0% |
9 | 0.25 | 5.77 4 | 3.606 0 | 3.5840 | 99.4% |
2.3.2数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.3.3 置信区间 在99%置信水平下。
2.3.4 结论 99%置信水平下，无异常值；按照AOAC（Guidelines for Single Laboratory Validation of Cheical Methods for Dietary Supplements and Botanicals）的要求，其RSD=C-0.15，应为≤2.3%～2.0%（高低浓度计算所得），表中RSD为1.3%，小于2.0%，符合规定。
2.4中间精密度 在同一个实验室内的条件改变，不同时间、不同分析人员、不同设备等测定结果之间的精密度，以考察随机变动因素。由2名检验员分别采用Agilent、Waters高效液相色谱仪，同时制备6份舒咽清喷雾剂供试品溶液，测定3批供试品，按正文拟定方法测定。
2.4.1 数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，两人的检验结果均未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.4.2结论 因为P值0.859大于0.05；所以两人测定结果，无显著差异。
2.5线性关系 系指在设计的范围内，线性试验结果与试样中被测物浓度直接呈比例关系的能力。取黄芩苷适量分别配制5个不同浓度水平的黄芩苷对照品溶液（浓度：0.251259mg/ml），分别精密吸取上述标准溶液，按正文拟定方法测定，以黄芩苷对照品溶液含量为横坐标X，以黄芩苷对照品峰面积为纵坐标Y，求线性回归方程。
2.9.1结果见表4。
表4 线性关系
Table 4 Linear Relationship
序号 | 对照品溶液浓度（mg/ml） | 进样体积（μl） | 进样量C（μg） | 峰面积A |
1 | 0.251359 | 2.51359 | 7366568 | |
2 | 0.15568 | 10 | 1.2568 | 3720716 |
3 | 0.06284 | 10 | 0.6284 | 1858712 |
4 | 0.03142 | 10 | 0.3142 | 930972 |
5 | 0.01571 | 10 | 0.1571 | 463794 |
标准曲线：Y=2929395.9X+14868.0，r=0.99998 | ||||
2.3.2 数据分析 计算相关系数，r=0.99998。
2.3.3 结论 因为r为0.99998大于相关系数临界值0.9912（自由度f=3），所以进样量与峰面积存在相关关系。
2.4耐用性 系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于常规检验提供依据。
2.4.1供试品溶液稳定性
2.4.1.1 续滤液稳定性 取舒咽清喷雾剂供试品溶液，在24h内选择6个时间点（0h、4h、8h、12h、16h、24h）分别取续滤液，按正文拟定方法测定，测定结果见表5。（标准规定：RSD≤SD）。
表5 供试品续滤液稳定性
Table 4 Stability of the Test Sample Filtrate
时间（h） | 含量（mg/ml） |
8.85 | |
4 | 8.84 |
8 | 8.83 |
12 | 8.85 |
16 | 8.84 |
24 | 8.86 |
2.4.1.2数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.4.1.3 数据分析 在95%置信水平下，进行回归分析。
表6 回归分析
Table 6 Regression Analysis
参数 | 标准误差 | P-value | 下限 95.0% | 上限 95.0% |
截距 | 0.007225 | ＜0.0001 | 8.8192 | 8.8593 |
斜率 | 0.0005446 | 0.3809 | -0.0009763 | 0.002048 |
2.4.1.4 结论 因为斜率p值0.3809大于0.05，所以含量随时间无显著变化趋势。
2.4.2整体稳定性 取舒咽清喷雾剂供试品溶液续滤液，在0小时测定；24、48小时后，样品再过滤，取续滤液测定，按正文拟定方法测定，结果见表12（标准规定：RSD≤SD）。
2.4.2.1结果见表7.
表7 供试品续滤液稳定性
Table 6 Stability of the Test Sample Filtrate (repeated)
时间（h） | 含量（mg/ml） |
8.85 | |
24 | 8.82 |
48 | 8.81 |
2.4.2.2数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.4.2.3 数据分析 在95%置信水平下 ，进行回归分析。
表8 回归分析结果
Table 8 Regression Analysis Results
参数 | 标准误差 | P-value | 下限 95.0% | 上限 95.0% |
截距 | 0.007454 | 0.0005364 | 8.7520 | 8.9414 |
斜率 | 0.0002406 | 0.1789 | -0.003890 | 0.002223 |
2.4.2.4 结论 因为斜率p值0.1789大于0.05，所以含量随时间无显著变化趋势。
2.5仪器精密度
分别取加样回收率试验中低浓度供试品溶液、舒咽清喷雾剂供试品溶液、加样回收率试验中高浓度供试品溶液，分别连续进样6次，按正文拟定方法测定。根据表9看出，系统适用性符合规定。
表9 中间精密度
Table 9: Intermediate Precision
供试品溶液 | 含量（mg/ml） | 平均值 | RSD | |||||
低浓度 | 4.8469 | 4.8388 | 4.8646 | 4.8498 | 4.8399 | 4.8465 | 4.8 | 0.2% |
中浓度 | 8.7760 | 8.7786 | 8.7837 | 8.7903 | 8.7805 | 8.7824 | 8.8 | 0.1% |
高浓度 | 11.5434 | 11.5660 | 11.5697 | 11.5643 | 11.5598 | 11.5545 | 11.6 | 0.1% |
黄芩苷含量在4.8~11.6mg/ml范围内，中国药典2025版通则05812液相色谱法对于重复性的RSD规定应不大于2.0%，因为表中RSD均小于2.0%，故符合规定。
2.6色谱柱
取3批舒咽清喷雾剂，同时制备6份供试品溶液，分别使用1、Waters公司SunFire C18 5µm 4.6×250mm，2、资生堂公司 CAPCELL PAK MG 4 C18 5µm 4.6×250mm，3、默克 Hibar RP-18 4.6×250mm×5µm的色谱柱，按正文拟定方法测定。
2.6.1 数据异常值评价 在99%置信水平下，用迪克森检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.6.2 结论 从方差分析，因为F值0.02596小于临界值F crit（5.1433），所以不同比例下的测量结果无显著差异。
2.7流速
取舒咽清喷雾剂，同时制备6份供试品溶液，分别在0.8ml/min、1.0 ml/min、1.2ml/min范围内，按正文拟定方法测定。
2.7.1 数据异常值评价 在99%置信水平下，用格拉布斯检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.7.2 数据分析 在99%置信水平下，用格拉布斯检验法（中国药典2025年版通则1431）进行分析，未检测出异常值，数据集中最小值和最大值均被视为有效数据点。
2.7.3 数据分析 在99%置信水平下，进行单因素方差分析。
2.7.4 结论 从方差分析，因为F值0.5173小于临界值F crit（6.3589），所以不同流速下的测量结果无显著差异。
3. 结语
本文构建的黄芩含量测定的测定方法，发现黄芩苷在酸性溶液中比在中性溶液中稳定。 弥补了现有医药分析检测领域中对黄芩苷在供试品溶液中的不稳定性考虑不足的理论空白，为后续同类分析检测方法的建立提供了新的理论依据和技术支撑。
参考文献
[1]聂翠翠. HPLC在绿原酸和黄芩苷制剂中含量测定的应用[D]. 武汉：湖北中医药大学,2012.
[2]于波涛,张志荣,刘文胜,等. 黄芩苷稳定性研究[J]. 中草药,2002,(3).
[3]王雷,王学艳,周雪琴,等. 黄芩苷在不同溶媒中的稳定性研究[J]. 中国药师杂志,2006,(2): 129-132.
[4]鲍建才,冯雪,黄志桓,等.加味双黄连口服液中黄芩苷含量控制分析[J].人参研究,2025,37(6):45-47.
[5]万思梦.铜胁迫和水杨酸处理对黄芩细胞氧化还原态及黄芩苷、黄芩素含量的影响[D].江西科技师范大学,2025.
[6]杨海燕,甘灿云,李敏洁.2020年版《中国药典》收载制剂中黄芩的使用与质量控制探讨[J].中医药管理杂志,2025,33(12):42-47.
[7]张晓燕,张慧,岳文梅,等.蒙药并头黄芩指纹图谱及含量测定研究[J].中南药学,2025,23(11):3356-3360.
[8]王云龙,陈立柱,张宇.高效液相色谱法同时测定宁神灵颗粒中黄芩苷和甘草酸铵的含量[J].黑龙江医药,2025,38(02):249-251.
[9]马凯. 基于液相色谱法串联质谱联用的化学毒品快速检测方法[J].粘接,2025,52(12):189-192.
[10]程伟,明龙,周月,等. 基于高效液相色谱技术的复杂药物成分分析及教学实践[J].粘接,2025,52(11):171-174.
[11]陈江枫. 基于液相色谱结合技术的化妆品质量检测[J].粘接,2025,52(10):145-147+151.
[12]朱新甜,欧阳少琴,王语诗,等.基于粉末颜色数字化的黄芩生长方式判别分析及主要药效成分含量的准确预测[J].中草药,2025,56(03):1008-1015.
[13]黄丽.UPLC法同时测定紫龙金片中野黄芩苷等8种成分的含量[J].中国药品标准,2024,25(04):392-397.
[14]马永璠,薄天儒,于亚杰,等.高效液相色谱法测定益肾排石颗粒中黄芩苷含量[J].吉林中医药,2024,44(05):590-594.
[15]褚莉,齐元春,孙利,等.基于高效液相色谱法的儿童清肺丸中汉黄芩苷含量测定[J].临床合理用药,2024,17(08):168-171.
[16]成程,陈向梅,马健,等.高效液相色谱法测定柴桂解表颗粒中黄芩苷含量的研究[J].海军医学杂志,2024,45(01):91-94.
李沅芸（1997.6）女，籍贯（广西桂林），汉族，本科学历，助理工程师，职务，研究方向：分析检测，邮箱：1243399519@qq.com
订阅方式：
①在线订阅（推荐）：www.sdchem.net.cn
②邮局订阅：邮发代号24-109
投稿方式：
①在线投稿（推荐）：www.sdchem.net.cn
作者只需要简单注册获得用户名和密码后，就可随时进行投稿、查稿，全程跟踪稿件的发表过程，使您的论文发表更加方便、快捷、透明、高效。
②邮箱投稿：sdhgtg@163.com sdhg@sdchem.net
若“在线投稿”不成功，可使用邮箱投稿，投稿邮件主题：第一作者名字/稿件题目。
投稿时请注意以下事项：
①文前应有中英文“题目”、“作者姓名”、“单位”、“邮编”、“摘要”、“关键词”；
②作者简介包括：姓名、出生年、性别、民族、籍贯或出生地、工作单位、职务或职称、学位、研究方向；
③论文末应附“参考文献”，执行国标GB/T7714-2005标准，“参考文献”序号应与论文中出现的顺序相符；
④注明作者的联系方式，包括电话、E-mail、详细的通讯地址、邮编，以便联系并邮寄杂志。
欢迎投稿 答复快捷 发表迅速