小儿积散的质量标准研究(定稿）

　　

小儿积散的质量标准研究

王朝山[1] 盛平¹ 陈静梅² 张炎才² 翁立冬²*

(1. 广州三九脑科医院药剂科 510515； 2. 广州南方医科大学中医药学院 510515)

摘要 目的：建立小儿积散的质量控制标准方法。方法：采用薄层色谱法对制剂中槟榔、木香、甘草和石榴皮进行定性鉴别；以使君子中胡芦巴碱的含量为指标，采用高效液相色谱法测定方中胡芦巴碱的含量，色谱柱：Agilent zorbax NH₂柱，250mm×4.6mm 5μm；流动相：乙腈-水(80:20)，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长265nm。结果：定性鉴别中检出石榴皮、槟榔、木香、甘草，薄层斑点清晰，且分离度好、专属性强，阴性对照无干扰；胡芦巴碱含量在0.16～0.80μg范围内与峰面积呈良好的线性关系y=0.0008x+0.0004 (r=1)；测得平均回收率为99.2%，RSD为0.73% (n=6)，每1g样品中含胡芦巴碱0.2308mg。结论：所建立的质量控制方法准确、可靠、专属性强，可以用于小儿积散的质量控制。

关键词：小儿积散；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法；胡芦巴碱

中图分类号：R 284.1

The quality specification research of Xiaoerji Powder

WangChaoshan¹ ShengPing¹ ChenJingmei² ZhangYancai² WengLidong²

(1. Guangzhou Southern Medical University Guangzhou College of traditional Chinese medicine 510515; 2. Guangzhou Sanjiu Brain Hospital Department of Pharmacy 510515)

Abstract Objective: To establish the quality standards of Xiaoerji Powder. Methods: With each other by thin-layer chromatography of Pericarpium Granati, Semen Arecae, Radix Aucklandiae and Radix et Rhizoma Glycyrrhizae for qualitative identification. Take contents of Trigonelline as index, make quantitative analysis and technology investigation with high efficiency liquid chromatography.The HPLC system consisted of Agilent zorbax NH2(250mm×4.6mm, 5μm), acetonitrile-water (80:20) as the mobile phase and the flow rate was 1mL/min, the column temperature was 30℃, and the detection wavelenth was 265nm.Results: Pericarpium Granati, Semen Arecae, Radix Aucklandiae and Radix et Rhizoma Glycyrrhizae were identified by thin layer chromatography. The characteristic identification was distinct and highly specific. Trigonelline in 0.16～0.80 μg scope with the peak area showed a good linear relationship between y=0.0008x+0.0004 (r=1); the average recovery was 99.2%, RSD was 0.73% (n=6), each g sample ambiguous trigonelline 0.2308mg. Conclusion：The quality control method is reliable, accurate and specific. It can be used for quality control of Xiaoerji Powder.

Key Words: Xiaoerji Powder；Quality Standards；TLC；HPLC；Trigonelline

小儿积散是由使君子、槟榔、木香、雷丸、石榴皮、甘草、贯众、牵牛子、百部、茯苓、山药等11味中药组成的复方制剂，具有驱虫止痛，健脾益气功效^[1]。临床用于小儿蛔虫、蛲虫等症之腹痛、面黄、体弱、偏食、食滞疳积、肛门瘙痒等。《中国药典》2010版一部尚未收载该成药，目前该成药被收载于国家卫生部中药部颁标准Z5-21册，标准编号为WS3-B-0891-91，除性状检查项外，鉴别项为显微鉴别，专属性较低。文献报道^[2]中的标准只对木香和甘草进行薄层鉴别专属性不强，为有效地控制其质量，采用TLC法对槟榔、木香、甘草、石榴皮等君药和臣药进行薄层鉴别；使君子为方中君药之一，具有驱虫消积的作用，用于小儿虫证，小儿疳积等症，用HPI C法测定君药使君子中葫芦巴碱的含量更能体现该制剂的质量。经方法学考察认为本方法简便、准确、专属性强，为控制该产品质量提供了依据。研究如下。

1 仪器设备与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪(Agilent G1322A脱气机、Agilent G1311A泵、Agilent G1313A自动进样器、Agilent G1316A柱温箱、Agilent G1315B紫外检测器)；Cp225D电子天平(德国，赛多利斯)；CP225D电子天平(德国，赛多利斯)；超声波清洗机(规格型号：KH-100DE，昆山禾创超声仪器有限公司)，硅胶G薄层板(青岛海洋和自制)；胡芦巴碱(批号110883-200502)、槟榔(批号120915-201312)、木香(批号120921-201309)、甘草(批号120904-201318)、石榴皮(批号121043-200403)等对照品和对照药材均购自中国食品药品检定研究所；小儿积散(广西梧州制药集团股份有限公司)；乙腈为色谱纯(德国Oceanpak公司)，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯(广州化学试剂厂)。

2 实验方法

2.1 薄层色谱鉴别^[3～6]

2.1.1 槟榔薄层色谱鉴别^[7]

取本品5g，加氯仿40mL和浓氨试液5mL，超声处理30分钟，滤过，滤液用2%盐酸溶液30mL萃取，萃取液用浓氨试液调pH值至8～9，再用氯仿萃取2次，每次30mL，合并氯仿液，水浴蒸干，残渣加氯仿1mL使溶解，作为供试品溶液。另取槟榔对照药材1g，同上述方法制成对照药材溶液。按处方药材比例及制法，制成缺槟榔的阴性对照样品，取相当于供试品的量，同上述方法制成槟榔的阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-浓氨试液(7.5:7.5:0.2)为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无斑点，如图1。

1 2 3 4 5 6

1、2、3.供试品 4、5.对照药材 6.阴性对照

图1 槟榔薄层色谱图

2.1.2 木香薄层色谱鉴别^[8]

取本品5g，加甲醇10mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液；另取木香对照药材0.5g，同上述方法制成对照药材溶液。按处方药材比例及制法，制成缺木香的阴性对照样品，取相当于供试品的量，同上述方法制成木香的阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲苯(7:1.5:1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无斑点，如图2。

1 2 3 4 5 6

1、2、3.供试品 4、5.对照药材 6阴性对照

图2 木香薄层色谱图

2.1.3 甘草薄层色谱鉴别^[9,10]

取本品5g，加乙醚50mL，水浴加热回流1小时，滤过，弃去乙醚液，药渣加甲醇30mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次30mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次50mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1g，同上述方法制成对照药材溶液。按处方药材比例及制法，制成缺甘草的阴性对照样品，取相当于供试品的量，同上述方法制成甘草的阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB))试验，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(10:20:7:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无斑点，如图3。

1 2 3 4 5 6

1、2、3.供试品 4、5.对照药材 6.阴性对照

图3 甘草薄层色谱图

2.1.4 石榴皮薄层色谱鉴别^[11]

取本品5g，加无水乙醇30mL，水浴加热回流1小时，滤过， 滤液蒸干，残渣加水20mL使溶解，滤过，滤液用石油醚(60～90℃)振摇萃取2次，每次20mL，弃去石油醚液，水液再用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取石榴皮对照药材2g，同上述方法制成对照药材溶液。按处方比例及制法，制成缺石榴皮的阴性对照样品，取相当于供试品的量，同上述方法制成石榴皮的阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各10μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10 :1 :1 : 1)为展开剂，展开，取出，晾干喷以2%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无斑点，如图4。

1 2 3 4 5 6

1、2、3.供试品 4、5.对照药材 6.阴性对照

图4 石榴皮薄层色谱图

2.2 含量测定^[11]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent zorbax NH₂(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：乙腈-水(80:20)；柱温：30℃；流速：1mL/min；检测波长：265nm。理论踏板数按胡芦巴碱峰计应不得低于4000。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取葫芦巴碱对照品适量，加50%甲醇溶解，并制成每1mL含80μg的葫芦巴碱溶液，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，精密称取4g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率100W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.3 阴性溶液的制备 按处方药材比例，取除使君子外的其余药材，按照制备工艺制得阴性对照样品，再按“2.2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.2.3 方法学考察及系统适应性分析

2.2.3.1 专属性考察 精密吸取上述三种溶液各10μL注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下进行检测，可见胡芦巴碱在22～23min出现特征吸收峰，而阴性对照无吸收峰，说明该色谱条件检测方法专属性良好，如图5～7。

对照品

供试品

阴性

图5～7 小儿积散 (胡芦巴碱)高效液相色谱图

2.2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取对照品标准液1、2、3、4、5mL至5mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀。以10μL注入高效液相色谱仪，以测得的峰面积x为横坐标，含量y为纵坐标，计算回归方程，经线性分析得：y = 0.0008 x + 0.0004(r=1)，结果表明葫芦巴碱进样量在0.16～0.80μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，如表1和图8。

表1 葫芦巴碱标准曲线测定结果

体积(mL)	峰面积	葫芦巴碱(μg)
1	198.6	0.16
2	397.2	0.32
3	595.8	0.48
4	794.4	0.64
5	994.3	0.80

图8 葫芦巴碱标准曲线图

2.2.3.3 精密度试验 在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液10μL，连续进样6次，测得峰面积，胡芦巴碱峰面积积分值的RSD值为0.27%，结果表明仪器及方法的精密度良好，结果见表2。

2.2.3.4 重复性试验 取同一批号样品 (130501) 6份，每份4g，精密称定，按“2.2.2.2”项下制备6份供试品溶液，分别测得峰面积，并计算胡芦巴碱的平均含量为0.2308mg/g，结果测得胡芦巴碱含量的RSD值为0.40%，结果表明方法的重复性试验良好，结果见表2。

2.2.3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于4，8，12，16，20，24h以10μL进样测定，胡芦巴碱峰面积的RSD值为0.50%，结果表明供试品溶液至少在24h内稳定，结果见表2。

表2 胡芦巴碱精密度试验、重复性试验和稳定性试验数据

测定项目		1		2		3	4		5		6	RSD(%)
精密度试验	峰面积	992.6	996.8		994.5			993.9		995.2	989.1	0.27
重复性试验	含量(mg/g)	0.2309	0.2321		0.2300			0.2307		0.2316	0.2297	0.40
稳定性试验	峰面积	460.1	458.7		461.4			459.6		464.7	463.3	0.50

2.2.3.6 加样回收率 精密称取6份已知含量(0.2308mg/g，批号130501)的同批样品2g分别置于6只25mL容量瓶中，再分别精密加入胡芦巴碱标准品溶液(0.08mg/mL)6mL，加50%甲醇至25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，各以10μL进样，测定含量，计算回收率。结果胡芦巴碱的平均回收率为99.2%，RSD值为0.73%，表明加样回收率试验较高，结果如表3。

表3 加样回收率试验

编号	称取量(g)	胡芦巴碱含量(mg)	加入量(mg)	测得含量(mg)	回收率(%)	平均回收率(%)	RSD (%)
1	2.0002	0.4616	0.48	0.9413	99.9	99.2	0.73
2	2.0003	0.4617	0.48	0.9382	99.3
3	2.0001	0.4616	0.48	0.9338	98.4
4	2.0003	0.4617	0.48	0.9357	98.8
5	2.0001	0.4616	0.48	0.9420	100.1
6	2.0000	0.4616	0.48	0.9345	98.5

2.2.4 结果

从表2计算可以得出，单批小儿积散样品中胡芦巴碱的平均含量约为0.2308mg/g。由于暂无法考察更多批次的小儿积散制剂中胡芦巴碱含量，考虑到实际生产中批与批之间药材含量也有一定区别，为使能更好体现制剂的质量要求，暂定小儿积散中含使君子以胡芦巴碱计不得少于0.15mg/g。

2.3 讨论

2.3.1 对本品组方中槟榔、木香、甘草和石榴皮进行定性鉴别试验，其中薄层定性鉴别分离度好，斑点清晰；在薄层色谱鉴别中，各对照药材，阴性对照的制备提取均与制剂的制备提取工艺相同，能保证试验的平行性。

2.3.2 为了考察方法的适用性，在试验中分别以自制版，预制硅胶G 版展开，主斑点分离效果均很好，且阴性对照无干扰；对各薄层色谱鉴别方法进行了低温度及高湿度条件考察，除石榴皮的鉴别中，低温度对其主斑点分离效果有影响外，其他药材的鉴别方法在低温度和高湿度条件下，均能实现较好的分离效果，且阴性无干扰；本试验还对各方法进行稳定性考察，结果表明，在考察的时间内，溶液中所被鉴别的成分均能够稳定存在。

2.3.3 在进行石榴皮的定性鉴别试验时，曾尝试用硅胶G板鉴别，分别以①丁酮-氯仿(2:1)，②甲苯-甲酸乙酯-甲酸(1:5:1)，③甲苯-甲酸乙酯-甲酸(2:10:0.3)展开，结果：条件①分离效果不是很明显，斑点重叠；条件②主斑点分离效果好，阴性无干扰，但Rf值偏高；条件③斑点分离效果好，Rf值适中，但主斑点颜色过浅，加大点样量后，未能解决问题。故在参考药典方法之后，决定采用聚酰胺薄膜鉴别，实验结果分离度好，斑点清晰。

2.3.4 在进行甘草的定性鉴别试验中，曾参考《中国药典》2010年版一部“甘草”药材薄层色谱方法，采用1%氢氧化钠溶液制备硅胶G板鉴别，结果：展开剂分层且分离效果不好；在参考文献后，采用硅胶G板，以石油醚(60～90℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(10:20:7:0.5)展开，结果分离度好，斑点清晰。

2.3.5 在含量测定供试品提取中，比较用“超声处理30min”和“加热回流1小时”的方法提取，并分别测定胡芦巴碱的含量。结果，采用“超声处理30min”方法提取的胡芦巴碱含量高。

2.3.6 本文采用高效液相色谱法测定小儿积散中的胡芦巴碱的含量，并进行了方法学考察：专属性试验，线性关系试验，精密度试验，重复性试验，稳定性试验，加样回收率试验，结果都符合要求。

参考文献

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作者简介：王朝山（1984-）男，大学本科，药师，电话：13602406392，Email：WangchaoShan0823@163.com

*通讯作者：翁立冬（1983-），实验师，药师，主要从事医院药学及药品制剂研究。电话：13570411061，Email：37370614 @qq.com

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