肝得治片质量标准的研究
袁绍莉 徐宁宁 王娟
（徐州生物工程职业技术学院 江苏 徐州）
摘要:目的:通过试验摸索肝得治片的质量控制方法，建立质量标准草案。方法：处方中的丹参、甘草和五味子采用薄层色谱法进行定性鉴别；黄芩苷采用高效液相色谱法进行含量测定。结果：构建了丹参、甘草和五味子的鉴别方法；黄芩苷进样量在 0.023 —0.460μg之间与积分值呈线性关系。回归方程y=2E+07x-30012；相关系数r＝0.9998。平均加样回收率达97.88%，重复性试验RSD%值为0.91%。结论：本方法能对肝得治片进行定性、定量检测，结果准确、可靠。
关键词：肝得治片；黄芩苷；定性鉴别；薄层色谱；高效液相色谱
肝得治片由五味子、黄芩、桑葚、丹参、甘草五味药物组成，具有滋补壮强，扶正固本，益味增食。用于黄疸胁痛，积聚，体质虚弱，倦怠乏力，面色不华，大便不实，舌质淡，脉细弱者之慢性迁延性肝炎、慢性活动性肝炎及肿瘤的综合治疗。为了本品内在质量的有效控制，对其主要成分黄芩苷进行含量测定，对处方中的丹参、甘草和五味子进行了鉴别，从而进行定性。
1、试药与仪器
高效液相色谱仪（waters515）；紫外检测器（waters2487）；Packing Material Lichrospher5-C18(250×4.6mm)色谱柱；2F-I 型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；HB3120U超声仪（汉邦科技）；101-1A 型电热恒温鼓风干燥箱；五味子、 丹参、甘草三味药材的对照药材及黄芩苷对照品；甲醇为色谱纯；乙酸乙酯、三氯甲烷等为分析纯，水为重蒸馏水；肝得治片样品及阴性对照品由实训室提供。
2、鉴别
2.1取本品适量，研细，称取2.0g，加水15ml，超声处理20分钟，加稀盐酸调节PH值至2，加乙酸乙酯20ml，振摇提取，水浴将提取液蒸干，向残渣中加入甲醇1ml，溶解后作为供试溶液。称取1.0g丹参对照药材，加入适量的水，煎煮半小时，滤过后加水至15ml，用同样的方法将对照药材制成溶液。采用薄层色谱法，各吸取2μl上述两种溶液，分别点在同一块硅胶G板上，用以三氯甲烷－丙酮－甲酸（25:10:4）展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，放置10分钟，在紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同顔色的荧光斑点。
1 2 3 4
1、2---供试品
3---丹参对照药材
4---空白对照
2.2称取本品3.0g，加入40ml乙醚后加热回流1小时，过滤，向药渣中加入30ml甲醇进行超声处理半小时，滤过，滤液蒸干，向残渣中加40ml水进行溶解，加入水饱和正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次40ml，将正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取1g甘草对照药材，同法操作。用薄层色谱法，吸取各3µl上述两种溶液，分别点于同一薄层板上，以乙酸乙酯—甲酸－冰醋酸－水（15：1：1：2）展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点组。
1 2 3 4
1---甘草对照药材
2、3---供试品
4---空白对照
2.3取 2.0g本品，加20ml三氯甲烷，进行超声处理半小时，滤过，滤液蒸干，向残渣中加入1ml三氯甲烷，溶解后作为供试品溶液。另取1.0g五味子对照药材，同法操作。用薄层色谱法，吸取各3μl上述两种溶液，分别点于同一以CMCNa为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以石油醚（30-60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）展开干后置254nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点组。
1 2 3 4
1---五味子对照药材
2、3---供试品
4---阴性对照
3、含量测定
3.1色谱条件及系统适用性试验
（1）色谱柱的选择：
选择使用C18—ODS反相柱。填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，做了柱长200mm与250mm的比较，确定了（4.6×250mm,5μm）的色谱柱分离效果较佳。
（2）流动相的选择： ①甲醇-水-冰醋酸(40：60：1)时，出现拖尾现象。
②甲醇-水－磷酸(47∶53：0.2)时，分离度良好且峰形较好。出峰时间约在11分钟。
③乙腈－0.1％磷酸溶液（22：78）时，分离度较差，但仍有拖尾现象。所以，确定了该比例的甲醇-水－磷酸(47∶53：0.2)为流动相，较为适宜。 （3）检测器的选择 釆用紫外检测器，检测波长为280nm （4）对照品溶液的配制
取在60℃中减压干燥4小时的适量黄芩苷对照品，精密称定,加甲醇溶解使成1ml含黄芩苷20μg的对照品溶液。
（5）供试溶液的制备
取本品适量，研细，取0.1g，精密称定，精密加入50％甲醇50ml，超声30min，使溶解，冷后滤过，精密量取续滤液2ml，加入10ml的量瓶中，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。
3.2方法学考察
3.2.1空白试验
取空白样品和空白溶液，精密吸取黄芩苷对照溶液、样品溶液和空白溶液各5ul，分别进样，结果：黄芩苷峰位在10-12分钟之间，样品溶液有同样位置的吸收峰，而空白溶液则无吸收峰。
3.2.2线性试验 精密称定适量黄芩苷对照品，加入甲醇使成每1ml含20ug的溶液。分别精密吸取1ul、5ul、8ul、10ul、15ul、20ul用液相色谱仪测定峰面积。对峰面积与进样量进行直线回归处理。得回归方程y=2E+07x-30012；相关系数r＝0.9998。表明黄芩苷进样量在 0.023 —0.460μg之间与积分值呈线性关系。
表1:线性试验
|
进样量(ug) |
0.023 |
0.115 |
0.184 |
0.230 |
0.345 |
0.460 |
|
峰面积 |
545015.5 |
2609495 |
4160636 |
5296790 |
8036801 |
10596042 |
3.2.3系统精密度考察
精密称取黄芩苷对照品溶液（21ug／ml）10μl连续6次进样，测定峰面积，计算RSD值为0.46%，结果见下表2。
表2:系统精密度试验
|
序号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 | |
|
峰面积 |
4866321 |
4803145 |
4827584 |
4855475 |
4836890 |
4830152 | |
|
RSD值（%） |
0.46 | ||||||
3.2.4重复性考察 精密称定称取6份样品，照供试液制备方法进行处理，进行重复性试验，结果如下：
表3：重复性实验结果 批号：20141101
|
序号 样品峰面积 样品含量(mg/片) 平均含量(mg/片) RSD值（%） |
|
1 3909685 18.10 2 3920547 17.93 3 3852819 18.16 18.09 0.91 4 3913868 18.34 5 4002592 17.90 6 3750027 18.15 |
结果表明重复性良好。
3.2.5中间精密度
不同分析人员，分别于五日内在不同仪器上对样品进行含量测定，考察中间精密度。结果见表3。
表3：中间精密度试验测定结果 批号：20141101
|
序号 样品峰面积 样品含量(mg/粒) 平均含量(mg/粒) RSD值（％） |
|
1-1 3958761 17.77 1-2 3988546 2-1 3725484 18.01 2-2 3815785 3-1 3905875 17.90 17.82 1.03 3-2 3862514 4-1 4058794 17.53 4-2 4115789 5-1 3901345 17.87 5-2 3855879 |
结果表明：中间精密度良好，符合规定。
3.2.6回收率试验 釆用加样回收法，精密称定6份已知黄芩苷含量的同批样品，，加入对照品，按供试溶液制备法制备供试溶液，测定后计算回收率。结果见表4：
表4：加样回收率试验结果 批号：20141101
|
编号 加入量(mg) 测得值(mg) 样本含量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) |
|
1 4.8 8.873 4.152 98.35 2 4.8 8.761 4.127 96.55 3 4.8 9.006 4.370 96.60 97.88 1.06 4 4.8 9.114 4.393 98.35 5 4.8 9.061 4.337 98.41 6 4.8 8.879 4.126 99.01 |
结果表明试验方法的回收率高，符合含量测定要求。
3.2.7稳定性试验 精密吸取供试品溶液10μl，液相色谱仪测定。分别于0、1、3、6、12、24小时后测定一次。结果依次为3835781、3897789、3869874 、3834587、 3889454、 3845788，RSD%为0.71%。表明供试溶液至少在24小时内稳定。
3.2.8样品含量测定 依上述建立的含量测定方法，对十批肝得治片中试样品定量，结 果见下表：
表六：十批中试样品含量测定
|
样品批号 |
试验号 |
峰面积 |
平均峰面积 |
平均含量 (mg/片) |
|
20141101 |
1 |
3814575 |
3828145 |
17.54 |
|
2 |
3841714 | |||
|
20141102 |
1 |
3648794 |
3622335 |
16.93 |
|
2 |
3595876 | |||
|
20141103 |
1 |
3747848 |
3768370 |
18.17 |
|
2 |
3788892 | |||
|
20141104 |
1 |
2924789 |
2960152 |
13.94 |
|
2 |
2995514 | |||
|
20040505 |
1 |
3641145 |
3664871 |
17.15 |
|
2 |
3688597 | |||
|
20141106 |
1 |
3025474 |
2968563 |
13.13 |
|
2 |
2911652 | |||
|
20141107 |
1 |
3515746 |
3605102 |
16.55 |
|
2 |
3694458 | |||
|
20141108 |
1 |
3178915 |
3171837 |
14.28 |
|
2 |
3164758 | |||
|
20141109 |
1 |
3847591 |
3823818 |
18.40 |
|
2 |
3800045 | |||
|
20141110 |
1 |
2514758 |
2493108 |
10.97 |
|
2 |
2471457 |
4、分析与总结
（1）根据相关文献，我们对样品与黄芩苷对照品进行了扫描，在同一波长处均出现了最大吸收值,表明肝得治片样品中被测物质即为黄芩苷。同时空白试验表明,阴性样品在黄芩苷对照品的最大吸收值处无吸收,表明方中其他味药材不干扰黄芩苷的测定。
（2）在高效液相测定黄芩苷过程中发现，黄芩苷样品用甲醇溶解进样峰形不是很理想，改用50％甲醇峰形改善，且超声时间以30分钟为宜。
（3）五味子、丹参、甘草的薄层鉴别，经考察，专属性、重复性、重现性皆良好，可以作为肝得治片的鉴别反应方法采用。
参考文献
1.《中华人民共和国药典》2010版一部[S]北京化学工业出版社.
2.部颁标准《中药成方制剂》第十二册（WS3-B2331-97）
3.刘文尧，刘云。高效液相色谱法测定清喉咽颗粒剂中黄芩苷的含量[J]。药物分析杂志，1998，18（5）：321-323.
4.莫可元，莫志江。RP－HPLC测定龙胆泻肝口服液中黄芩甙含量[J]。中成药，2000，22（11）：764。
5.陈定一.分析化学[M].学苑出版社,1995
6.张执侯.有机化学[M].上海科学技术出版社,1986
7.肖崇厚,陆蕴如等.中药化学[M].上海科学技校术出版社,1985
8.任仁安,陈瑞华等.中药鉴定学[M].上海科学技术出版社,1986
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