免疫亲和柱净化-HPLC测定植物油中黄曲霉毒素

　　

免疫亲和柱净化-HPLC法测定植物油中黄曲霉毒素

赖宣丞¹ ，廖长儒²，曾德斌³

（1.2.3均为海南省疾病预防控制中心检验检测所理化科 海南海口 570203）

摘要：目的 建立一种免疫亲和柱净化-高效液相色谱同时测定植物油中黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G₂的方法。方法 试样用甲醇水（55+45，体积比）提取，提取液经离心、过滤、稀释后，用免疫亲和柱净化，采用高效液相色谱-大体积流通池荧光检测器检测。结果 在优化条件下，黄曲霉毒素B₁ , G₁的检出限分别为0.067μg/kg，黄曲霉毒素B₂ , G₂的检出限分别为0.02μg/kg,回收率范围为94.0%-105.7% 。结论 该方法简便快速，灵敏度高，重复性好，可满足植物油中黄曲霉毒素含量检测的需要。

关键词： 黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁和G₂；HPLC；大体积流通池；植物油

Detecting of aflatoxin B₁ ,B₂ ,G₁,G₂ in vegetable oil by HPLC with immunoaffinity columns

LAI xuan-cheng

(Hainan Provincial Center for Disease Control and Prevention,Laboratory of Physical and Chemical Test,Hainan 570203,China)

Abstact:Objective A method for the detecting of aflatoxin B₁ ,B₂ ,G₁,G₂ in vegetable oil by HPLC with immunoaffinity columns was established. Methods Samples were extracted with methanol -ater（55＋45）solution. After oscillated and centrifugated,he lower layer of extraction was filtered,iluted with water and filtered. The filtrate was then passed through immunoaffinity column,hen determined by fluorescence detector with large volume flow cell. Results Under optimum conditions,he limits of detection of aflatoxin B_1, G₁ were 0.067μg / kg,he limits of detection of aflatoxin B_2, G₁were 0.02μg / kg,Respectively and the recoveries of aflatoxin were 94.0%-105.7%.The method is simple,apid and accurate,and is applicable for the determination of aflatoxins in vegetable oil.

Key words： aflatoxin B₁ ,B₂ ,G₁,G₂; large volume flow cell.; vegetable oil

作者简介：赖宣丞（1987-），女（黎族），海南万宁人，助理工程师，本科学士学位，主要从事食品检测工作，电话：18808919601，E-mail:laialive@163.com。

黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉和模式曲霉等在合适的温度和湿度条件下产生的真菌毒素，广泛存在于各类粮油制品中。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为I类致癌物，其毒性是氰化钾的10倍, 砒霜的68倍，也是所有真菌毒素中最稳定的一种，对公众健康有极大的危害。经鉴定的黄曲霉毒素有 20 多种，常见的有 B₁ , B₂ , G₁和G₂^【1】。当人体黄曲霉毒素摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。

目前检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、毛细管电泳法、高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MSMS）等。薄层色谱法操作繁琐、耗时长、污染大、定量差、灵敏度差; 酶联免疫吸附法虽操作简单, 灵敏度高, 但特异性差、重复性差, 易出现假阳性。HPLC因其高效、快速、灵敏度高、重现性好、准确可靠等优点而得到越来越广泛的应用。传统的HPLC检测法需柱前加三氟乙酸或柱后加碘衍生, 实验中试剂使用较多,衍生过程复杂、操作繁琐, 灵敏度及重现性受人为因素影响大^[8]。因此，建立一种快速、较环保的花生油中黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G₂含量测定方法是十分必要的。

1 仪器与试剂

1.1仪器

美国Waters公司超高效液相色谱仪ACQUITY Hclass配荧光检测器( 带大体积流通池) ；BS124S电子分析天平；涡旋振荡器；离心机

1.2试剂

黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G₂混标（O2i公司，编号116870-01-1ML，B₁浓度为1.003mg /L，B₂浓度为0.2979 mg /L，）G₁浓度为0.9996 mg /L，G₂浓度为0.2976 mg /L，纯度为98%） ；黄曲霉毒素总量免疫亲和柱 （Pribolab公司，）；甲醇HPLC级（Tedia 公司）；乙腈HPLC级（Tedia 公司）；玻璃微纤维滤纸（Whatman公司）；水为超纯水；样品来源于本检验所抽验品。

2 方法部分

2.1色谱条件

色谱柱：太玮科技ADE-PAKTM ODS-AQ（5μm 250×4.6μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（18:18:64）；激发波长：362nm，发射波长：440nm；进样量：10μL；流量：0.5mL/min；柱温：35℃

2.2实验方法

2.2.1提取

准确称取5.0g样品，置于50mL离心管中，加入1.0g氯化钠。加入25.0mL甲醇-水（55:45）。涡旋振荡，让样品与提取液充分混合；振荡10min，以7000r/min离心10min；取下层提取液玻璃微纤维滤纸过滤。

2.2.2免疫亲和柱净化

将免疫亲和柱连接固相萃取装置，准确移取15mL澄清液过免疫亲和柱，以每秒钟一到两滴的流速淋洗柱子，使2-3mL空气进入亲和柱中，重复淋洗柱子一次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体。

2.2.3免疫亲和柱洗脱

在固相萃取装置里面装上接收瓶，用2.0mL色谱级甲醇分三步进行洗脱，重力洗脱。先加0.5mL甲醇洗脱，过柱前孵育30秒以上（孵育即甲醇在柱子中浸泡），重力过柱，当溶剂通过柱子后，等待30秒后再加入0.5mL甲醇进行洗脱，再次孵育30秒以上再进行重力洗脱，最后一次加入1.0mL甲醇孵育后进行重力洗脱。收集全部洗脱液供检测用。

2.2.4液相色谱测定

由低至高浓度顺序进样 6 个混合标准工作液，进样量 10μL，对照标准储备液中的保留时间，确定混合工作液中的黄曲霉毒素保留时间，以质量浓度为纵坐标，对应峰面积为横坐标，绘制标准曲线，以保留时间定性，外标法定量。图 1 为混合标准溶液色谱图。

图1

3结果与讨论

3.1提取条件优化

分别采用甲醇-水溶液比例（45:55）、（55:45）、（65:35）提取样品，通过多次比较，确定甲醇-水比例为55∶45时，回收率稳定在90％ ~105％ 之间。

3.2洗脱条件优化

SNT 3868-2014^[2]中采用分别加两次0.6mL甲醇进行洗脱，但是单纯的洗脱不够完全，定量不准。经过多次反复实验，采用三次甲醇洗脱加上孵育（孵育即甲醇在柱子中浸泡），回收率良好，洗脱完全。

3.3方法验证

3.3.1线性范围

表 1 黄曲霉毒素标准溶液浓度曲线

编号	浓度水平/（ng/mL）
	B1	B2	G1	G2
1	0.307	0.091	0.306	0.091
2	0.614	0.182	0.612	0.182
3	1.228	0.365	1.224	0.364
4	2.457	0.730	2.449	0.729
5	4.914	1.460	4.898	1.458
6	9.829	2.919	9.796	2.916
相关系数	0.9995	0.9994	0.9994	0.9991

按上述色谱条件测定如表1所示浓度标准工作溶液，结果显示，4 种毒素在0 -9.829 范围内有良好线性关系，相关系数均在0.999 以上。

3.3.2方法检出限和定量限

以三倍信噪比，按方法的称样量和定容体积计算，则黄曲霉毒素B_1、G₁的方法检出限为0.067μg/kg，定量限为0.22μg/kg；黄曲霉毒素B_2、G₂方法检出限为0.02μg/kg，定量限为0.067μg/kg。

3.3.3方法精密度实验

分别取不同量的黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G₂与植物油的空白样品混合，按样品的处理方法提取后，测定方法的精密度，见表2。结果可见，黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G₂方法的相对标准偏差RSD（%）在2.30~3.48之间，表明本方法的精密度良好。

表2 方法的精密度（n=6）

组别	平均浓度（ng/mL）	相对标准偏差RSD
B1	0.307	0.0305
	1.228	0.0247
	4.914	0.0239
	9.829	0.0322
B2	0.091	0.0255
	0.730	0.023
	2.919	0.0311
G1	0.612	0.0318
	2.449	0.0288
G2	0.091	0.0348
	2.916	0.0244

3.3.4方法回收率实验

将植物油精确称取后，分别加入一定量的黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G_2，混合制成高中低3个不同量的加标样品，每个加标量取6个平行样品，按样品的处理方法提取后，应用高效液相色谱色谱仪分析，测得平均回收率，见表3.结果可见；黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G_2，方法回收率在94.0%~105.7%之间，表明本方法的准确度良好。

表3回收率实验（n=6）

组别	本底值（ng/mL）		加标量（ng/mL）	平均测定值（ng/mL）	回收率（%）
B1	0.62	0.614		1.235	100.2
		1.228		1.832	98.7
		4.914		5.622	101.7
B2	/	0.182		0.175	96.2
		0.730		0.691	94.7
		1.460		1.442	98.8
G1	/	0.612		0.618	101.0
		2.449		2.588	105.7
		4.898		5.001	102.1
G2	/	0.182		0.171	94.0
		0.719		0.752	104.6
		1.458		1.512	103.7

4.结论

本研究建立了免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测植物油中黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G_2，的分析方法，并对方法的准确性及精密度进行了验证。研究表明，经免疫亲和柱净化，能够快速、特异地将黄曲霉毒素从样品中分离出来，净化程序简单、净化率高，适合于复杂基质中黄曲霉毒素的检测。该方法用于植物油中黄曲霉毒素B₁ , B₂ , G₁，G_2，的检测，灵敏准确、重复性好、特异性高、简便快速、应用范围广，满足植物油B₁ , B₂ , G₁，G_2，安全的检测要求。

5.建议

由于黄曲霉毒素是高致癌物质，接触过黄曲霉毒素的物品需置于6%次氯酸钠消毒液中浸泡至少30min，然后用洗涤液、自来水、三蒸水依次洗涤。

[1]杭州大学分析化学教研室. 分析化学手册 第二分册［M］ .北京：化学工业出版社， 1997： 608 -631.

[2] 国家质量监督检验检疫总局SNT 3868-2014 出口植物油中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的检测-免疫亲和柱净化高效液相色谱法［S］.北京：中国质检出版社 中国标准出版社，2014,7

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